肿瘤个体化治疗检测技术指南(试行)

4. 分析前质量保证

4.1 样本类型及获取
4.1.1 新鲜组织(包括手术和活检组织)

肿瘤新鲜冷冻材料可提取出最高品质的DNA、RNA。在手术现场取样的情况也比较多,但需要在显微镜下确认肿瘤细胞含量。周围炎症严重的肿瘤、黏液产生过高的肿瘤、病变中心广泛纤维化的肿瘤细胞不能采集,以免产生假阴性结果。切割后取其中一半,并利用另一半切面制作组织标本,然后进行确认。

手术切除的组织样本理想的保存方法是迅速置于液氮中,然后保存于液氮罐或-80℃冰箱,这一过程应在手术样本离体后30分钟内完成。由于组织样本通常需先进行病理学分析,在分析完成后应尽早将组织样本置于稳定剂中,避免核酸降解。

4.1.2 石蜡包埋组织(formalin-fixed paraffin-embedded,FFPE)

10%中性福尔马林固定手术切除样本,按病理学操作规范进行取材。

制作石蜡切片时,切取5片连续切片,其中1片进行HE染色,确认肿瘤细胞的含量。在高灵敏度检测方法中,可考虑使用活检标本。

DNA容易受固定的影响,长时间(1周以上)浸泡在福尔马林中的样本的DNA会被片段化,不能检出突变。活检材料的固定时间一般是24小时,对于穿刺等活检样本,固定时间控制在6~24小时为佳。

4.1.3胸腹水等细胞学样本

用胸腹水中的肿瘤细胞用于基因检测时,必须确认肿瘤细胞,穿刺获得胸腹水样本提交给细胞病理检查之后,剩余液体冷藏/冷冻保存,也可在含有细胞成分的离心沉淀中加入含有蛋白质变性剂的缓冲液(AL缓冲液,Qiagen公司)等室温保存。由于细胞学样本的肿瘤细胞含量较低,因此必须使用高灵敏度检测方法。

4.1.4 血浆样本

循环DNA(circulating free DNA,cfDNA)是存在于血浆中的游离DNA,肿瘤来源的DNA占血浆游离DNA的比例在不同肿瘤及病例中相差悬殊(0.01~93%),从而限制了外周血在肿瘤分子检测时的应用。目前已有多篇文献证实可利用从血浆游离DNA检出突变,但需要使用ARMS法等灵敏度非常高的检测方法。

采集外周血提取血浆游离DNA进行检测,取样时应使用一次性密闭EDTA抗凝真空采血管,采集6~10ml全血,冷藏运输,6小时内分离血浆,提取游离DNA,保存到-80℃冰箱中,并避免反复冻融。如外周血需长时间运输,建议用商品化的游离DNA样本保存管,在常温条件下,cfDNA在全血中可稳定保存7天。

4.2 采样质量的评价

肿瘤细胞是否存在,是开展肿瘤个体化治疗基因检测的重要前提。如果要确认肿瘤细胞存在,与病理诊断医生密切合作是非常必要的。

采样评价内容包括:细胞组成、肿瘤细胞的数量,是否按照要求进行处理与运输。评价方法包括肉眼观察、显微镜下观察和浓度分析等。

肿瘤组织切片等应经病理医师审阅,取一张切片HE染色后显微镜下观察,确保肿瘤细胞存在,并记录肿瘤组织含量,标注肿瘤细胞密集区域。

4.3 样本采集中的防污染

样本采集最好采用一次性材料,不用处理便可直接使用;

制备不同患者病理切片样本时,需更换新刀片,并清除操作器皿上先前样本的残留;

采集中要特别注意防止污染,防止混入操作者的毛发、表皮细胞、痰液等;

如使用玻璃器皿,必须经高压灭菌,以使可能存在的DNase失活;

如提取RNA样品,必须采用RNase抑制剂措施和无RNase材料。

4.4 样本运送和保存

原则上按照《个体化医学检测质量保证指南》要求进行。

实验室应建立详细的样本运送标准操作规程(SOP),对临床医生提供样本采集手册,要求物流人员填写相关运送记录表,确保运送过程中样本的安全性和过程的可控性。

需要转送的样本:用于RNA检测的样本,如果未经稳定化处理,则必须速冻后,放在干冰中运送。

经过适当稳定化处理的样本可在常温下运送,如用于DNA扩增检测的EDTA抗凝全血样本及用于RNA扩增检测的经稳定化处理的样本。

 

5.分析中质量保证

5.1 实验室设计要求

原则上按照《个体化医学检测质量保证指南》要求进行。在符合国家卫生计生委要求的个体化医学检测实验室和通过审核验收的临床基因扩增检验实验室完成。

5.2 检测方法
5.2.1 Sanger测序法

5.2.1.1技术原理

Sanger测序法即双脱氧链终止法(Chain Termination Method),利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成,每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP),并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团,使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整,使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点,但终止在不同的的核苷酸上,可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段,凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。

5.2.1.2技术特点

该方法是DNA序列分析的经典方法,最直接的、可检测已知和未知突变的一种方法。由于该方法可直接读取DNA的序列,因此被认为是基因分型的金标准。

主要优点:测序长度较长,可发现新的变异位点,包括一些新的少见的突变形式及突变的确切类型,如点突变、片段缺失。

局限性:灵敏度不高,突变等位基因需要超过20%才能检出。对样本中肿瘤细胞的含量和比例要求较高,一般要求肿瘤细胞含量不低于50%,如果肿瘤细胞比例低于50%,则假阴性出现的概率会显著增加;不适用于活检或细胞学样本。

5.2.2焦磷酸测序法(Pyrosequencing)

5.2.2.1技术原理

焦磷酸测序技术是由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应。当测序引物与模板DNA退火后,在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶等4种不同酶的协同作用下,将引物上每一个dNTP聚合时释放的焦磷酸基团(PPi)与一次荧光信号的释放偶联起来,通过检测荧光的释放和强度,达到实时测定DNA序列和定量分析序列变化的目的。

5.2.2.2技术特点

焦磷酸测序技术是一种新型的酶联级联测序技术,其重复性和精确性可与Sanger测序相媲美,而测序速度则大大提高,非常适合对已知的短序列进行重测序分析。

主要优点:检测灵敏度为10%,相对Sanger测序法高,对体细胞突变和甲基化等可实现定量检测;分型准确可靠,通量较高,实验设计灵活,可发现新的突变或遗传变异。

局限性:测序长度较短,不能对长片段进行分析。检测灵敏度中等,难以检出低于10%的突变。不适用于活检或细胞学样本。

5.2.3新一代测序 (next generation sequencing,NGS)

5.2.3.1技术原理

NGS又称大规模平行测序(MPS),包含多种可以一次性产生大量数字化基因序列的测序技术,是继Sanger测序的革命性进步,采用平行测序的理念,能够同时对上百万甚至数十亿个DNA分子进行测序,实现了大规模、高通量测序的目标。不同厂家的产品测序原理不同,主要分为边合成边测序(Sequencing by synthesis,SBS)、基于“DNA簇”和“可逆性末端终结(Reversible Terminator)大规模平行测序、 4色荧光标记寡核苷酸的连续连接反应测序和半导体芯片测序。

5.2.3.2技术特点

高通量测序技术不仅可以进行大规模基因组测序,还可用于基因表达分析、非编码小分子RNA的鉴定、转录因子靶基因的筛选和DNA甲基化等相关研究。

主要优点:高通量测序技术有三大优点是传统Sanger测序法所不具备的。第一,它利用芯片进行测序,可以在数百万个点上同时阅读测序。第二,高通量测序技术有定量功能,样品中DNA被测序的次数反映了样品中这种DNA的丰度。第三、利用传统Sanger测序法完成的人类基因组计划总计耗资27亿美元,而现在利用高通量测序技术进行人类基因组测序,测序成本只需1千美金。

局限性:检测灵敏度和测序深度相关,一般来说,NGS在肿瘤体细胞突变检测时,检测灵敏度为10%;已知的与肿瘤相关驱动基因数量有限,疾病表型和基因型的关系还有赖于生物信息的解读,目前NGS应用于肿瘤细胞突变检测的标准化和质量控制尚未形成共识。

5.2.4扩增阻滞突变系统 (ARMS)-PCR法

5.2.4.1技术原理

扩增阻碍突变系统(amplification refractory mutation system, ARMS)是PCR技术应用的发展,也称等位基因特性PCR(allele-specific PCR,AS-PCR)等,用于对已知突变基因进行检测。该法通过设计两个5`端引物,一个与正常DNA互补,一个与突变DNA互补,对于纯合性突变,分别加入这两种引物及3`端引物进行两个平行PCR,只有与突变DNA完互补的引物才可延伸并得到PCR扩增产物。如果错配位于引物的3`端则导致PCR不能延伸。

5.2.4.2技术特点

ARMS-PCR是目前实验室常用的基因突变检测方法。

主要优点:ARMS-PCR法检测灵敏度高,可检测肿瘤细胞中突变比例为1%甚至更低的突变基因。

局限性:只能检测已知的突变类型,不能发现一些新的、未知的突变;如果检测的突变位点或类型较多,则随着引物数目增加出现非特异性结合的概率也相应增加;当检测位点较多时,对DNA样本量的需求增加。

5.2.5 高分辨率熔解曲线(HRM)法

5.2.5.1技术原理

高分辨率熔解曲线(high-resolution melting,HRM)是一种基于PCR新型技术,用于检测基因变异包括未知的基因变异、单核苷酸多态性以及基因甲基化。HRM是基于在加热过程中双链变性为单链的原则。DNA双链体的熔解温度差异反应了基因的变异。双链DNA片段在其特定的温度熔解,熔解的温度由片段的CG含量、序列组成、长度以及一个和多个杂合碱基决定。用DNA嵌合的染料可以看到任何双链片段的熔解峰图,在有荧光嵌合染料的情况下PCR扩增片段,扩增后的产物通过一个快速的可控的加热处理开始熔解。荧光水平在升温的过程中实时监测,染料随着双链DNA的熔解,荧光信号逐渐减少。

5.2.5.2技术特点

由于HRM分析不受碱基突变位点和种类的限制,可用于突变扫描、基因分型、序列匹配、DNA甲基化等方面的研究。

主要优点:检测灵敏度1%,特异性高,重复性好;封闭体系,减少污染的可能性;扩增和检测同时进行,无需PCR后进行处理。

局限性:通过熔解曲线的图不能判断某一特异性的变异体,下游分析中检测需要有测序等补充。

5.2.6 数字PCR(Digital PCR)

5.2.6.1技术原理

数字PCR是一种核酸分子绝对定量技术。相较于qPCR,数字PCR能够直接数出DNA分子的个数,对起始样品绝对定量。通过将一个样本分成几万到几百万份,分配到不同的反应单元,每个单元包含一个或多个拷贝的目标分子( DNA 模板) ,在每个反应单元中分别对目标分子进行PCR 扩增,扩增结束后对各个反应单元的荧光信号进行统计学分析。数字PCR技术不断发展,Bio-Rad、LIFE Technologies、Fluidigm及RainDance等厂家相继推出技术较为成熟的数字PCR产品。

5.2.6.2技术特点

数字PCR目前的应用包括:稀有等位基因检测、基因表达绝对定量、核酸标准品绝对定量、二代测序文库绝对定量等。

主要优点:灵敏度可达0.001~0.0001%,高特异性,可检测复杂背景下的靶标序列;可高度耐受PCR反应抑制剂;不必依赖对照品或标准品,可对目标拷贝数直接进行精确的鉴定,分析微小的浓度差异;实验数据分析便捷,每个微滴的检测结果以阴性、阳性判读,数据分析自动化;可统计突变率,通过统计分析可得出靶点的突变率。

局限性:数字PCR仪通量较低,目前通常能检测的信号为FAM和HEX。一般单个反应2重反应效果最佳;数字PCR优点是灵敏度高,但是对于DNA浓度大的样本处理就没有优势,而且核酸浓度高时,每个微滴里面包含的拷贝数不符合泊松分布;数字PCR虽然不依赖标准曲线,但是每次反应之间存在差异,短期内不能代替qPCR,也不能代替其他金标准而作为首选方法。QX200等数字PCR仪目前仅用于科研用途,数字PCR走向临床检验还需要一段时间。

5.2.7荧光原位杂交(FISH)

5.2.7.1技术原理

荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization, FISH)是通过荧光标记的DNA探针与细胞核内的DNA靶序列杂交,并在荧光显微镜下观察分析其结果的一种分子细胞遗传学技术。它的基本原理是:如果被检测的染色体或DNA纤维切片上的靶DNA与所用的核酸探针是同源互补的,二者经变性-退火-复性,即可形成靶DNA与核酸探针的杂交体。将核酸探针的某一种核苷酸标记上报告分子如生物素、地高辛,可利用该报告分子与荧光素标记的特异亲和素之间的免疫化学反应,经荧光检测体系在镜下对待测DNA进行定性、定量或相对定位分析。

5.2.7.2技术特点

FISH主要可对基因缺失、基因融合、基因扩增进行检测。

主要优点:可多种荧光标记,显示DNA片段及基因之间的相对位置与方向,空间定位精确;灵敏、特异性好,可同时分析分裂期和间期的多个细胞,并进行定量;可以检测隐匿或微小的染色体畸变及复杂核型。

局限性:FISH检测对操作和判读技术要求较高,诊断医师必须经过严格的FISH操作和结果判读培训,只有经FISH操作经验丰富的医师判定的结果才具有可靠性;目前FISH检测的成本昂贵、通量低。

5.2.8免疫组化(IHC)

5.2.8.1技术原理

免疫组化(Immunohistochemistry,IHC)分析利用抗体和抗原之间的结合的高度特异性,借助于组织化学的方法将抗原抗体结合的部位和强度显示出来,以其达到对组织或细胞中的相应抗原进行定性、定位或定量的研究。

5.2.8.2技术特点

IHC作为筛查工具优于FISH,具有经济快捷的优点,尤其适用于大量样本的检测分析。影响IHC结果的因素主要包括抗体的选择、检测前组织的固定,观察者解释方面的差别等。

 

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评论 ( 2 )
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