肿瘤个体化治疗检测技术指南（试行）

附录A：常见的检测项目

A.1 基因突变检测项目

A.1.1 EGFR基因突变检测

【基因简介】 EGFR是原癌基因c-erbB1的表达产物，是表皮生长因子受体（HER）家族成员之一。HER家族由EGFR/HER1/erbB1、HER2/neu/erbB2、HER3/erbB3及HER4/erbB4四个分子构成，在细胞的生长、增殖和分化等生理过程中发挥重要的调节作用。

【常见突变】 EGFR的突变主要发生在胞内酪氨酸激酶（TK）区域的前四个外显子上（18~21），目前发现的TK区域突变有30多种。缺失突变主要发生在外显子19上，最常见的是del E746-A750，替代突变最常见的是发生在外显子21上的L858R，复制或插入突变发生在外显子20上。发生在外显子20上的替代突变T790M为耐药突变，研究还发现L858Q、D761Y、T854A等耐药突变。

【EGFR基因突变和EGFR-TKI敏感性】 EGFR-KTI的有效性也因突变类型而不同，外显子19缺失突变的有效率为81%，L858R的有效率为71%，G719X的有效率为56%。吉非替尼初期有效的全部患者，在后期均产生耐药。其中50%患者是在19外显子缺失或L858R点突变等的敏感突变的基础上，又发生了第790位密码子苏氨酸向蛋氨酸的突变（T790M）。研究发现有约1～3%的患者在TKI治疗前即存在T790M，即原发耐药，这种情况下TKI治疗难以有效。

【检测样本类型】 经10%中性福尔马林固定、石蜡包埋的非小细胞肺癌肿瘤组织。

【检测方法】推荐ARMS或Sanger测序法进行EGFR突变检测，可考虑采用新一代测序技术同时进行肺癌驱动基因的检测。

【临床意义】

（1）预测药物疗效：EGFR是HER/ErbB家族信号通路的首要分子，吉非替尼、厄洛替尼等小分子TKI进入细胞内，直接作用于EGFR胞内的激酶区，干扰ATP合成，抑制酪氨酸激酶的活性，阻断激酶的自身磷酸化及底物的磷酸化，彻底阻断异常的酪氨酸激酶信号传导，从而阻止配体介导的受体及下游信号通路的激活，阻滞细胞在G1期，促进凋亡，抑制新生血管形成、侵袭和转移，达到治疗的作用。小分子TKI的疗效与EGFR基因突变密切相关，是TKI疗效预测因子。

（2）预后评价：根据是否使用EGFR-TKI对肺癌切除后患者进行预后分析，EGFR敏感性突变并服用TKI的患者至少在单因素分析中有预后良好的趋势。但是，EGFR基因突变与女性、非吸烟者等这些传统的预后良好因子有交叉，只分析基因突变进行预后评价几乎是不可能的。

【用药建议】

（1）吉非替尼、厄洛替尼等小分子酪氨酸激酶抑制剂的疗效与EGFR基因发突变密切相关，特别是当第19外显子缺失、第21外显子突变（L858R）和第18外显子突变（G719X）的患者，使用吉非替尼、厄洛替尼等小分子TKI可获益。

（2）约1~3%未经TKI治疗的NSCLC患者第20外显子存在T790M突变，但经TKI治疗后超过50%后耐药的患者出现T790M突变阳性，导致TKI治疗失败。也有报道认为L747S、D76IY、T854A突变阳性时，患者也会对吉非替尼、厄洛替尼等小分子酪氨酸激酶抑制剂耐药。

【局限性】临床实践表明，并不是所有携有EGFR突变的NSCLC患者都对酪氨酸激酶抑制剂有效，EGFR-TKI的有效性因突变类型而不同，如对外显子19缺失突变的肿瘤患者有效率为81%， L858R的有效率为71%，G719X的有效率为56%，而有些患者发生第20外显子插入突变却对TKI无效。另外，约10%的EGFR野生型NSCLC患者对酪氨酸激酶抑制剂有效，但其机制尚不明确。

A.1.2 KRAS基因突变检测

【基因简介】 哺乳动物基因组中普遍存在三种RAS癌基因家族成员：H-RAS、K-RAS、N-RAS，这三种基因编码的蛋白质大约有90%的氨基酸同源序列，分子量均为21kDa，故称为RASp21蛋白，其在功能上与G蛋白相似，可与二磷酸尿苷（GDP）结合为非活性状态，与三磷酸尿苷（GTP）结合为活性状态，RASp21 蛋白自身具有弱GTPase活性，位于细胞膜内侧参与跨膜信号传递作用。

KRAS基因是RAS基因家族中三种癌基因的一种，位于12号染色体上，含有4个编码外显子和1个5’端非编码外显子，共同编码含189个氨基酸的RAS蛋白。KRAS是表皮生长因子受体功能信号的下游分子，属膜结合型GTP／GDP结合蛋白，通过GTP和GDP的相互转化作用有节制的调节KRAS基因对信号系统的开启和关闭，传递细胞生长分化信号。

【KRAS基因的常见突变】KRAS基因突变发生在肿瘤恶变的早中期，并且原发灶和转移灶的KRAS基因状态基本保持一致。目前研究发现，KRAS基因在膀胱、乳腺、直肠、肾、肝、肺、卵巢、胰腺、胃，还有造血系统等均在一定频率的突变，其中以结直肠癌、胰腺癌和肺癌的发生率比较高，在胰腺癌组织高达90％以上，在肺癌中则以肺腺癌为主，突变率为20～30％，结直肠癌患者突变率为27～43％。当KRAS基因催化活性区突变时，该基因永久活化，不能产生正常的RAS蛋白，导致RAS蛋白不依赖EGFR受体激活而持续活化，造成RAS信号通路的异常活化，影响细胞的生长、增殖和分化，促进细胞的恶性转化，导致细胞增殖失控而癌变。

KRAS基因最常见的突变方式为点突变，90％的KRAS基因突变位于2号外显子的第12和13密码子位点，另有1～4％为第61和146密码子突变。其中结直肠癌中第12密码子（约82％）是最常见的突变位点。一般中国人群样本检测数据G12A高于G12S/C，西方人群相反。

【检测样本类型】 经10%中性福尔马林固定石蜡包埋的结肠癌/肺癌肿瘤组织，或者与原发灶具有同样病理形态的转移组织。

【检测方法】可以采用Sanger测序法，也可采用灵敏度高的ARMS-PCR等。

【临床意义】 西妥昔单抗和帕尼单抗均通过直接抑制EGFR从而发挥抗肿瘤的作用，在结直肠癌和头颈部癌的靶向治疗中都有肯定的效果。西妥昔单抗治疗的有效性受其下游基因KRAS状态的影响，突变型的KRAS无需接受上游EGFR信号即能够自动活化该通路并启动下游信号的转导。因此只有KRAS基因野生型的患者才能从抗EGFR的治疗中获益，而突变型的患者则不能。

【用药建议】KRAS野生型患者使用西妥昔单克隆抗体和帕尼单克隆抗体治疗效果确切，可显著提高患者的生存率和改善生活状态，建议使用；而KRAS的2号外显子的12号密码子和（或）13号密码子或其他密码子任意突变型患者使用西妥昔单抗和帕尼单克隆抗体抗治疗无效，建议不使用该类药物。而在进行结肠癌靶向药物治疗时，应询问所有结肠癌患者的家族史，如果怀疑患者有遗传性非息肉病性结直肠癌(HNPCC)、家族性腺瘤性息肉病(FAP)和轻表型家族性腺瘤性息肉病(AFAP)，除非是进行临床试验，否则不应使用贝伐珠单克隆抗体、西妥昔单克隆抗体、帕尼单克隆抗体或伊立替康。

【局限性】临床实践表明，只有50%的野生型KRAS患者对抗EGFR治疗有效，提示EGFR下游信号通路其他分子的激活和变异可能影响了其治疗反应。因此，KRAS基因突变的检测仅用于预测结直肠癌对抗EGFR靶向药物的治疗效果。

A.1.3 BRAF基因突变检测

【基因简介】BRAF基因是1988年由Ikawa等首先在人类尤因肉瘤中发现并克隆确认的一种能转染NIH3T3细胞且有活性的DNA序列。BRAF基因与ARAF、CRAF基因同属RAF家族，命名为鼠类肉瘤滤过性毒菌致癌同源体B1，位于人染色体7q34，长约190kb，编码783个氨基酸的蛋白，相对分子质量为84436，有CR1、CR2和CR3三个保守区。BRAF是Ras-Raf-MEK-ERK信号转导通路重要的转导因子，具有功能的编码区由2510对碱基组成，主要通过有丝蛋白激酶通路中的丝氨酸苏氨酸蛋白激酶来发挥作用，该酶将细胞表面的受体和RAS蛋白通过MEK和ERK与核内的转录因子相连接，启动多种因子参与调控细胞内多种生物学事件，如细胞生长、分化和凋亡。研究表明，在多种人类恶性肿瘤中，如恶性黑色素瘤、结直肠癌、肺癌、甲状腺癌、肝癌及胰腺癌，均存在不同比例的BRAF突变。

【常见突变】BRAF突变主要有两种类型：1.11%位于exon11上的甘氨酸环，如G463、G465、G468的点突变；2.89％的突变发生在exon15上的激活区，其中约92％位于第1799核苷酸上，T突变为A(T1799A以前认为是T1796A)，导致其编码的谷氨酸由缬氨酸取代(V600E以前被认为是V599E)。此外，仅不到1％的癌组织同时存在BRAF突变与RAS突变，且在这1％中，BRAF突变几乎均为非V600E突变。以上两种类型的突变均能使BRAF激酶活性及NIH3T3细胞转化能力提高，但以后者更为重要。V600E突变能模拟T598和S601两个位点的磷酸化作用，使BRAF蛋白激活。

【BRAF突变与维罗非尼（vemurafenib）】2011年FDA批准维罗非尼用于治疗晚期（转移性）或不可切除的黑色素瘤，尤其是携有BRAF V600E基因变异肿瘤者。该药的安全性和疗效评估基于一项国际单中心研究。该研究纳入675例BRAF V600E变异的初治晚期黑色素瘤患者，入选者被随机分入维罗非尼组或达卡巴嗪组。结果显示，在维罗非尼组患者未达到中位生存期终点时（77%的患者生存），达卡巴嗪组患者中位生存期为8个月（64%的患者生存）。该药最常见副作用为关节痛、皮疹、脱发、疲乏、恶心和皮肤光敏感。
中国黑色素瘤患者中BREF V600E变异率接近26%，虽然不如白种人（约50%）的变异率高，但仍有可能通过这个药物治疗我国1/4黑色素瘤患者，因此该药物对于黑色素瘤患者的治疗有着十分重要的意义。

【检测样本类型】经10%中性福尔马林固定石蜡包埋的结肠癌肿瘤组织和黑色素瘤组织。

【检测方法】BRAF基因突变的检测方法进可以采用Sanger测序法，也可以使用ARMS-PCR等方法进行检测。

【临床意义】

（1）BRAF是位于KRAS下游级联信号通路上的一个重要蛋白，当BRAF基因发生突变后，其编码生成的蛋白产物无需接受上游信号蛋白的活化便始终处于激活状态，启动下游细胞信号转导途径，引起细胞增殖，从而使EGFR抑制剂西妥昔单克隆抗体和帕尼单克隆抗体等疗效减弱或无效。

（2）BRAF基因可作为患者预后评价的独立性指标，BRAF V600E突变患者呈现预后更差的趋势。

（3）BREF V600E基因突变的黑色素瘤患者对维罗非尼治疗有效。

【用药建议】

（1）对于KRAS基因野生型但同时具有BRAF基因V600E突变的患者，抗EGFR单克隆抗体靶向药物治疗可能无效。（2）回顾性亚组分析显示，无论BRAF基因V600E是否存在突变，一线治疗采用抗EGFR单克隆抗体联合有效的化疗药物都有可能使患者获益。目前有限的研究数据提示，一线治疗后病情进展的患者，如果存在BRAF V600E突变，使用抗EGFR单克隆抗体的疗效欠佳。

（3）50%以上表达BRAFV600突变的晚期黑色素瘤患者在维罗非尼治疗中可获得临床应答。

【局限性】

（1）BRAF基因突变的检测用于预测结直肠癌抗EGFR单克隆抗体靶向药物的治疗效果和预后，必要时必须结合NRAS、KRAS、PI3KCA等基因的突变的检测。

（2）研究发现黑色素瘤患者BRAF V600突变位点外，如携带BRAF L597和K601突变可能对BRAF抑制剂药物维罗非尼药物治疗敏感，但目前还需进一步开展研究来证实这些发现。

A.1.4 C-KIT基因突变检测

【基因简介】C-KIT基因位于人染色体4q11-21，属于原癌基因，其cDNA全长共5230bp，含有21个外显子，编码一个145KD的跨膜酪氨酸激酶受体(tyrosine kinase receptor，RTK)蛋白，命名CD117。第1号外显子编码起始密码子和信号肽，第2-9号密码子编码膜外配体结构域，第10号外显子编码疏水跨膜结构域，第11-20号外显子编码膜内结构域。其中11号外显子编码近膜区段。C-KIT受体属于III型RTK家族，分布于细胞表面，可以用CD117单克隆抗体检测，与血小板衍生生长因子受体(platelet-derived growth factor receptors，PDGFR)有很强的同源性。

【常见突变】多数胃肠道间质瘤（GIST）发生源于C-KIT基因突变，C-KIT突变主要发生在近膜区的外显子11，然后是外膜区的外显子9，酪氨酸区段的外显子13、14、17也可以发生突变。最近数据显示，约8~50%的大肿瘤GIST中可观察到典型的突变，突变频率约35%。在不同GIST中，C-KIT基因突变型式并不完全一样，最常见为第11号外显子突变，导致其编码的近膜结构域的空间结构改变，消弱或丧失对激酶结构域的抑制功能。

【C-KIT基因突变与伊马替尼疗效】甲磺酸伊马替尼（Imatinib mesylate）（商品名：格列卫）是一种口服的酪氨酸激酶抑制剂类药物，能够有效地选择性抑制所有类型的abl酪氨酸激酶活性，包括v-abl、PDGFR和C-KIT蛋白等。伊马替尼于2001年5月在美国上市，同年11月在欧洲上市，并于2002年4月在中国上市。最初被应用于费城染色体阳性的（Ph+）慢性粒细胞白血病（CML）的治疗，之后被批准用于胃肠道间质瘤的治疗，使得GIST治疗进入了分子靶向时代。

一般认为C-KIT/PDGFRA突变类型可以预测伊马替尼的疗效，其中C-KIT 外显子11突变者的疗效最佳；PDGFRA D842V 突变可能对伊马替尼与舒尼替尼原发耐药。舒尼替尼治疗GIST原发C-KIT外显子9突变者和C-KIT野生型者优于C-KIT外显子11突变患者；治疗继发性C-KIT外显子13、14突变患者疗效优于继发C-KIT外显子17、18突变者。

CSCO胃肠间质瘤专家委员会推荐存在以下情况时，应该进行基因学分析：①所有初次诊断的复发和转移性GIST，拟行分子靶向治疗；②原发可切除GIST手术后，中-高度复发风险，拟行伊马替尼辅助治疗；③对疑难病例应进行C-KIT 或PDGFRA突变分析，以明确GIST的诊断；④鉴别NF1型GIST、完全性或不完全性Carney’s 三联征、家族性GIST及儿童GIST；⑤鉴别同时性和异时性多原发GIST。

检测基因突变的位点，至少应包括C-KIT基因的第9、11、13和17号外显子及PDGFRA基因的第12和18号外显子。由于大多数GIST（65～85%）的基因突变发生在C-KIT基因的第11号或第9号外显子，对于经济承受能力有限的患者，在鉴别诊断时，可以优先检测这两个外显子；但是，对于继发耐药的患者，宜增加检测C-KIT基因的13、14、17和18外显子。

【检测样本类型】 经10%中性福尔马林固定石蜡包埋的GIST肿瘤组织。推荐检测的样本类型为治疗前的原发癌肿瘤组织或转移的肿瘤组织。

【检测方法】C-KIT基因突变的检测方法可以采用Sanger测序法、ARMS-PCR等方法检测特定的突变位点。

【临床意义】 （1）辅助诊断和预测疗效：伊马替尼是一种酪氨酸蛋白酶抑制剂，能阻断酪氨酸蛋白激酶KIT受体功能，从而抑制肿瘤的形成。已有研究证实，C-KIT基因突变的位置能影响肿瘤患者对伊马替尼、舒尼替尼等酪氨酸激酶抑制剂的反应。通过检测C-KIT基因的突变状态，协助GIST诊断，也可以进一步的明确诊断CD117阴性的患者，诊断家族性GIST，评价小儿GIST，指导化疗，预测化疗的效果。（2）预后评价：当C-KIT基因第11外显子发生突变后，患者预后较发生于C-KIT基因其他外显子或PDGFRA基因突变的患者或者未检测到C-KIT基因或PDGFRA基因突变的患者预后更差。来源于小肠或结肠的CIST如发生C-KIT基因第9外显子突变，较发生C-KIT基因第11外显子突变者更具有侵袭性。

【用药建议】伊马替尼、苏坦替尼等酪氨酸激酶抑制剂与C-KIT基因发突变密切相关，对发生于外显子9、11、12和17的原发性突变患者，使用伊马替尼、舒尼替尼等酪氨酸激酶抑制剂时，患者可从抗C-TKI靶向药物治疗中获益。当发生位于第13、14、17、18外显子的继发性突变时，则使用伊马替尼、舒尼替尼等酪氨酸激酶抑制剂出现耐药。

【局限性】由于存在肿瘤异质性，或肿瘤组织中混有大量正常组织，或坏死组织过多等，均有可能导致假阴性结果的产生。同时还有部分患者无法提供检测所需的组织样本，或组织样本无法满足检测的基本要求，或患者病情发展及治疗过程中会发生C-KIT基因状态的变化，均可导致治疗的失败。此外，C-KIT基因的突变与伊马替尼、舒尼替尼等酪氨酸激酶抑制剂敏感性之间的关系因人而异。伊马替尼、舒尼替尼等酪氨酸激酶抑制剂在体内的代谢受CYP450 3A4状态的影响，因此即使C-KIT基因突变阳性的患者，伊马替尼、舒尼替尼等酪氨酸激酶抑制剂亦不一定能达到预期临床疗效，需要考虑其他因素的干扰。

A.1.5 PDGFRA基因

【基因简介】PDGFR是分子量为180kD的单链膜糖蛋白，细胞外配体结合区含5个免疫球蛋白样结构域，具保守的半胱氨酸残基，单一跨膜片段；胞内的酪氨酸激酶区断裂处，为亲水氨基酸插入序列。受体分子由α，β两种亚基组成，成熟后的PDGFR以二聚体稳态形式(αα，αβ，ββ)与配体PDGF (platelet-derived growth factor，PDGF)相应异构体(PDGF-AA，AB，BB)结合。结直肠癌组织中PDGFR α和PDGFR β均有表达分布，PDGFR α分布于结直肠正常组织、息肉组织及肿瘤组织上；PDGFR β表达于肿瘤细胞、肿瘤间质细胞和微血管细胞（包括微血管周细胞）上。

【PDGFRA基因的突变】PDGFRA基因突变常见于GIST、胶质母细胞瘤、恶性外周神经鞘等肿瘤，其中GIST中PDGFRA基因突变率在5~10%左右，突变主要发生于PDGFRA基因的近膜端区域(外显子12)和激酶区(外显子14和外显子18)，突变频率分别为0.8%和3.9%，其中以外显子18突变为主。PDGFRA常见突变类型见。 PDGFRA基因突变后则通过活化AKT、MAPK及STAT蛋白中STAT1和STAT3发挥作用。也有研究发现活化的A-Raf激酶能调节PLCG1经PDCFR依赖途径的信号转导，也能调节PI3K经PDCFR非依赖的信号转导。

【检测样本类型】经10%中性福尔马林固定石蜡包埋的肿瘤组织。推荐检测的样本类型治疗前的原发癌肿瘤组织或转移的肿瘤组织。

【检测方法】PDGFRA基因突变的检测方法可以采用Sanger测序法、ARMS-PCR等方法检测特定的突变位点。

【临床意义】（1）辅助诊断和预测疗效：伊马替尼是一种酪氨酸蛋白酶抑制剂，能阻断酪氨酸蛋白激酶KIT受体功能，从而抑制肿瘤的形成。已有研究证实，PDGFRA基因突变的位置能影响肿瘤患者对伊马替尼、舒尼替尼等酪氨酸激酶抑制剂的反应。研究表明，PDGFRA基因外显子12和外显子18大部分基因位点突变后使用伊马替尼、舒尼替尼等酪氨酸激酶抑制剂治疗时GIST患者可从中获益。但如外显子18基因位点发生D842V、RD841-842KI或D1842-843IM突变使用伊马替尼、舒尼替尼等酪氨酸激酶抑制剂治疗时GIST患者不能从中获益。（2）预后评价：当PDGFRA基因发生突变后，肿瘤侵袭性较发生于KIT基因突变的患者侵袭性低。

【用药建议】伊马替尼、舒尼替尼等酪氨酿激酶抑制剂与PDGFRA基因发突变密切相关，对发生于外显子12中的Tyr555Cys和Asp56lVal突变及外显子18中的Asp846Tyr等突变患者，使用伊马替尼、舒尼替尼等酪氨酸激酶抑制剂时，患者可从中获益。当位于第18外显子中的D842V、RD841-842KI和DI842-843IM突变时，使用伊马替尼、舒尼替尼等酪氨酸激酶抑制剂则出现耐药。

【局限性】由于存在肿瘤异质性，或肿瘤组织中混有大量正常组织，或坏死组织过多等，无法避免假阴性结果的产生。同时还有部分患者无法提供检测所需的组织样本，或组织样本无法满足进行检测的基本要求，或患者病情发展及治疗过程中会发生PDGFRA基因状态的变化，均可导致治疗的失败。此外，PDGFRA基因突变与伊马替尼、舒尼替尼等酪氨酸激酶抑制剂敏感性之间的关系因人而异。同时伊马替尼、舒尼替尼等酪氨酸激酶抑制剂在体内的代谢受CYP450 3A4状态的影响，即使检测到了PDGFRA基因的突变，使用伊马替尼、舒尼替尼等酪氨酸激酶抑制剂不一定能达到预期临床疗效，需要考虑其他因素的干扰。