肿瘤个体化治疗检测技术指南（试行）

A.2 基因表达检测项目

A.2.1 HER2基因表达

【基因简介】原癌基因HER2位于染色体17q21，习惯上称为HER2／neu基因或c-erbB-2基因。编码分子量185kD的跨膜蛋白，因此又被称为p185 HER2，是具有跨膜酪氨酸激酶活性的生长因子受体。HER2受体介导的信号通路是一个复杂的网络系统，包括输入细胞层(配体或生长因子)、信息加工层(受体，SH2蛋白，转录因子)和输出层(细胞生长，分化和转移)。配体介导受体的二聚体是关键，使该信号系统能够传递多种生物信息，而缺乏特异性配体的HER2在整个信号网络中起调节作用。信号转导涉及的主要通路包括：Ras、Raf-Mek-MAPK、PBK、Akt激酶、cAMP(蛋白激酶A)、磷脂酶C-r和src等。HER2通过这些信号转导通路使细胞增殖周期变短，恶性表现增强和抗凋亡。

【HER2基因过表达与乳腺癌等】HER2基因在乳腺癌、膀胱癌、结直肠癌、胃癌和非小细胞肺癌等中均存在表达上调。许多研究资料表明，在20～30%的乳腺癌中存在HER2基因明显扩增或过表达，临床上HER2基因过表达的乳腺癌患者往往表现出生存率低、肿瘤恶性程度增强、进展迅速、易于发生淋巴结转移、化疗缓解期缩短，并对他莫昔芬(Tamoxifen)和很多细胞毒性化疗药耐药等，但对大剂量蒽环类、紫杉类药物疗效好。由于HER2基因位于细胞表面，易被抗体接近，故HER2基因可作为抗肿瘤治疗的一个靶点。

【检测样本类型】经10%中性福尔马林固定石蜡包埋的乳腺癌肿瘤组织。治疗前的原发肿瘤组织或转移的肿瘤组织。

【检测方法】对HER2基因表达的检测方法可以采用FISH、IHC、扩增显色原位杂交（CISH）等，目前也有实验室使用荧光定量PCR等方法进行检测，但该方法用于检测HER2基因的表达尚未得到认可。一般来说，实验室首先采用IHC方法进行HER2蛋白检测，如果检测结果为2+，则进行原位杂交(FISH)方法进行HER2基因检测确认。

【结果判读】

免疫组织化学（IHC）检测：

1）3+，HER2表达阳性；

2）1+或阴性，表达阴性；

3）2+时则需要进行FISH检测。

FISH检测：

1）HER2与CEP17信号数比值：≥2.0为阳性，有HER-2/neu基因扩增；

2）HER2与CEP17信号数比值：＜2.0时，

若HER2拷贝数≥6.0 为阳性，有HER-2/neu基因扩增；

若 HER2拷贝数＜4.0 为阴性，无HER-2/neu基因扩增；

若 HER2拷贝数≥4.0，但＜6.0时为不确定，不能确定HER-2/neu基因状态。

3）若众多信号HER2信号连接成簇时可不计算，即视为基因扩增。

【临床意义】准确分析HER2基因扩增状态是乳腺癌患者预后判断及制订有效治疗方案的先决条件，对乳腺癌的诊疗具有重要的指导作用。

（1）预后评价：研究显示，HER2基因的过表达除了与肿瘤的发生发展相关外，还是一个重要的临床预后指标，主要表现为HER2基因扩增的乳腺癌浸润性强、无进展生存期(progress free survival、PFS)短、预后差。而且这部分患者就诊时的肿瘤负荷更大，淋巴结转移的几率更高，激素受体阴性的比例更高、组织学分级更差、肿瘤的增殖指数更高、复发风险更高。但没有证据显示HER2基因扩增与导管原位癌( ductal carcinoma in situ，DCIS)的预后相关。

（2）内分泌药物疗效预测：研究显示，相对于无HER2基因扩增的乳腺癌患者而言，HER2基因扩增的患者应用他莫昔芬治疗后的死亡风险明显增高，因此这类乳腺癌患者可能不适合选择他莫昔芬作为内分泌治疗，而且HER2基因扩增的乳腺癌患者对CMF化疗方案的反应性降低，宜采用高剂量的蒽环类药物方案。

（3）靶向药物疗效预测：大量临床研究数据提示，使用曲妥珠单克隆抗体等治疗乳腺癌时，无论是与常规化疗联合用于乳腺癌患者的辅助治疗，还是用于辅助治疗后的维持治疗，及用于晚期乳癌患者的单药或联合治疗，都能肯定改善HER2基因扩增或蛋白过表达患者的生存，使乳腺癌患者获益。
即使在使用曲妥珠单抗治疗过程中出现疾病进展而需要进一步治疗的乳腺癌患者，继续使用曲妥珠单抗治疗仍然有效。而对于HER2基因低度扩增或不扩增的乳腺癌患者，使用曲妥珠单抗疗效不佳。

【用药建议】曲妥珠单抗及拉帕替尼等酪氨酸激酶抑制剂等乳腺癌靶向药物治疗乳腺癌的疗效与HER2基因表达状态密切相关，当HER2基因扩增时，使用曲曲妥珠单抗和拉帕替尼等酪氨酸激酶抑制剂时，患者可从抗HER2靶向药物治疗中获益。但如果发生PI3KCA基因突变、PTEN基因失活及HER2基因某些位点发生突变时，则会对曲妥珠单抗和拉帕替尼等酪氨酸激酶抑制剂耐药。

【局限性】由于方法学本身的局限性，IHC和FISH得出的均有不确定结果，无法对HER2基因状态做出明确判断。即使经IHC或FISH判断为HER2基因过表达的患者也未必一定能从靶向治疗中获益，导致这种现象的原因可能是检测体系本身所造成的假阳性，也可能是HER2基因的信号通路中还存在其他异常的位点。其次肿瘤异质性的存在导致IHC和FISH均无法避免假阴性结果的产生。还有部分患者无法提供检测所需的组织样本，或组织样本无法满足进行检测的基本要求，或患者病情发展及治疗过程中会发生HER2基因状态的变化，而IHC和FISH均无法对患者的HER2基因状态进行动态、实时的监测。

A.3融合基因检测项目

A.3.1 EML4-ALK融合基因检测项目

【基因简介】ALK，即人类间变性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase，ALK)，于1994年首先发现于间变性大细胞淋巴瘤AMS3细胞株中，是由1620个氨基酸组成的跨膜蛋白，属于胰岛素受体家族。EML4是人类棘皮动物微管相关蛋白样4(echinoderm microtubule-associated protein- like 4，EML4)，属于棘皮动物微管相关蛋白样蛋白家族，由N末端碱基区、疏水的棘皮动物微管相关蛋白区(hydrophobic echinoderm microtubule-associated protein-like protein，HELP)及WD重复区三部分构成。该融合基因定位于2号染色体的短臂上(2p21和2p23)，其5’端为EML4的片段，3’端为ALK的片段，由倒置后的EML4基因片段与残余的ALK片段连接。该融合基因拥有EML4基因中的BASIC区域，疏水的棘皮动物微管相关蛋白区及部分WD重复区(后两部分在部分亚型中缺失)和ALK基因中的Kinase功能区。EML4-ALK 的信号转导通路为PI3-K/Akt、STAT3/5、Ras-MEK 和PLC-γ/PIP2等，这些通路与细胞存活、增殖和迁移密切相关。

【EML4-ALK融合与克唑替尼】克唑替尼是一种酪氨酸激酶受体抑制剂，靶向分子包括ALK、肝细胞生长因子受体（HGFR，c-Met）和ROS1，于2011年获得美国食品和药品管理局（FDA）批准用于治疗间变型淋巴瘤激酶（ALK）基因重排的非小细胞肺癌（NSCLC）。EML4-ALK基因融合可促使ALK基因引起致癌融合蛋白的表达。ALK融合蛋白形成可引起基因表达和信号的激活和失调，进而促使表达这些蛋白的肿瘤细胞增殖和存活。克唑替尼在肿瘤细胞株中对ALK和c-Met在细胞水平检测的磷酸化具有浓度依赖性抑制作用，对表达EML4-ALK或NPM-ALK融合蛋白或 c-Met的异种移植荷瘤小鼠具有抗肿瘤活性在NSCLC患者中，ALK重排的阳性率大约为3～5%，在腺癌、从未吸烟或少量吸烟的患者中EML4-ALK融合的几率高。

【检测样本类型】经10%中性福尔马林固定、石蜡包埋的非小细胞肺癌肿瘤组织。推荐检测的样本为治疗前的原发癌肿瘤组织或转移的肿瘤组织

【检测方法】EMIA-ALK融合基因的检测方法有FISH、IHC、荧光定量PCR等，推荐的检测方法为FISH。

【临床意义】（1）预测药物疗效：EMLA-ALK融合基因阳性的NSCLC患者接受以铂类为基础的化疗，其有效率、疾病进展时间和总生存期与EGFR突变阳性NSCLC患者相似。相反，EML4-ALK融合基因阳性患者不能从EGFR-TKI的基础治疗中受益，表现为原发耐药，治疗结果与无EGFR基因突变的患者相似。而针对EML4-ALK融合基因阳性的患者，使用克唑替尼等针对ALK基因的小分子抑制剂可以获得良好的临床治疗效果。因此在使用针对ALK基因的小分子抑制剂前，需进行EML4-ALK融合基因突变的检测。

【用药建议】针对ALK基因的小分子抑制剂疗效与EML4-ALK融合基因密切相关，当存在EML4-ALK融合基因时，可以考虑使用针对ALK基因的小分子抑制剂治疗如克唑替尼，患者可以从中获益，而不应给予吉非替尼、厄洛替尼等EGFR-TKI类药物，患者不会从中获益。

【局限性】由于EML4-ALK融合基因检测方法FISH、IHC和RT-PCR检测的灵敏度不足及检测样本受正常组织干扰等因素的影响，容易造成检测结果的假阴性。同时EML4-ALK融合基因各种亚型患者在接受克唑替尼治疗时是否存在疗效差异尚不明确，也有待进一步研究。因此，使用克唑替尼治疗EML4-ALK融合基因阳性的NSCLC患者时，需要定期监测疗效。

A.4 基因甲基化检测项目

A.4.1 MGMT基因甲基化检测

【基因简介】人MGMT基因稳定地存在于所有正常组织细胞内，其编码的MGMT蛋白以分布在人体肝脏的活性最高，其次为淋巴结和肠道，骨髓细胞中的活性最低。MGMT蛋白在不需要任何辅助因子或其他蛋白质的条件下，可以催化DNA分子中鸟嘌呤O6位上的烷基转移至MGMT本身第145位的半胱氨酸残基上，鸟嘌呤损伤修复，DNA的结构和功能得以恢复。同时，这种催化作用是一种不可逆的反应，MGMT作用后由于获得烷基而失活，因此这种酶又是一种自杀蛋白。正常情况下，细胞内MGMT具有解除烷化剂对细胞的致癌作用和消除烷化类药物对于细胞毒性杀伤作用的双重生物学功能，而细胞对DNA鸟嘌呤O6位上烷基化修复能力的大小通常取决于MGMT在细胞内的含量和合成的速率。

【MGMT基因启动子甲基化】影响机体MGMT含量和活性的因素有很多，环境因素、机体器官状态和基因状态等。其中基因调节是影响MGMT蛋白含量和活性的主要因素，MGMT基因启动子甲基化是MGMT最常见的异常，多发生于MGMT启动子CpG岛，导致该基因转录停止，表达减少。许多肿瘤如脑胶质瘤、结直肠癌、肺癌、乳腺癌中存在MGMT基因甲基化并均可观察到MGMT启动子异常甲基化，启动子甲基化与19号染色体长臂丢失或19号染色体长臂与1号染色体短臂杂合丢失有关。如p53基因突变后能导致肿瘤细胞MGMT表达减少，活性降低。许多机体环境因素也影响MGMT蛋白的含量和活性，如乙基亚硝基脲、吸烟等可以使肝细胞中的MGMT蛋白表达量和活性明显增加。MGMT启动子发生甲基化的患者才可以从替莫唑胺治疗中受益。

【结果解释】正常人群基因组中MGMT基因启动子CpG位点为非甲基化状态，如果检测到基因组中存在MGMT基因启动子CpG位点的甲基化，提示MGMT基因编码MGMT蛋白的功能下降或MGMT活性降低。

【检测样本类型】经10%中性福尔马林固定石蜡包埋的脑胶质瘤肿瘤组织或者病理确证的活检组织。推荐检测的样本类型为治疗前的原发癌肿瘤组织。

【检测方法】MGMT基因启动子甲基化的检测方法建议采用MSP (methyl-specific polymerase chain reaction，甲基化特异的PCR)、甲基化特异性焦磷酸测序、HRM等方法。

【临床意义】（1）疗效预测： MGMT启动子发生甲基化的患者明显比未发生甲基化的患者使用烷化剂的疗效好，其总体生存率和无进展生存率更高。MGMT启动子区甲基化对胶质瘤一线化疗药物TMZ治疗胶质瘤的化疗疗效具有预测价值，且是独立的预后较好的指示指标。MGMT启动子未甲基化者从TMZ常规治疗方案中获益较小，应对这类患者采用更有效的有助于克服耐药的其他化疗方案。（2）预后评价：40%脑胶质瘤患者有MGMT启动子甲基化，甲基化程度越高，预后越差，其对肿瘤的预后和生存期的预示作用较肿瘤的分级、临床、年龄等其他特征更有效。

【用药建议】TMZ等烷化剂疗效与MGMT启动子区域甲基化状态密切相关，对发生了MGMT启动子区域甲基化的患者，且发生甲基化比例越高的患者，使用TMZ烷化剂治疗时，患者可从中获益。如未发生MGMT启动子区域甲基化的患者，使用TMZ烷化剂治疗则出现耐药。

【局限性】由于脑部肿瘤的特殊性，限制了肿瘤组织的来源，同时肿瘤组织的异质性、大量坏死组织或大量正常组织的存在，干扰了检测结果，导致检测结果的假阴性。同时，MGMT启动子区域甲基化程度与TMZ烷化剂的疗效之间的关系尚未阐明，MGMT基因表达水平也影响了TMZ烷化剂的疗效，且TMZ疗效也受其他因素的影响，因此尚不能根据MGMT启动子甲基化状态判断TMZ的疗效，仅仅是根据是否存在甲基化对TMZ的疗效进行预测。

参考文献：

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[2] Collection, Transport, Preparation, and Storage of Specimens for Molecular Methods; Approved GuidelineMM13-A

[3] Quality Management for Molecular Genetic Testing; Approved Guideline MM20-A

[4] Comparison of immunohistochemistry with fluorescence in situ hybridization in determining the human epidermal growth factor receptor 2 status of breast cancer specimens: a multicenter study of 3 149 Chinese patients. Chin Med J 2014;127 (2): 246-253

[5] 李艳，李金明. 《个体化医疗中的临床分子诊断》 人民卫生出版社 2013年8月

[6] NCCN临床实践指南：非小细胞肺癌（2015.V1）

[7] NCCN临床实践指南：结直肠癌（2015.V1）

[8] NCCN临床实践指南：乳腺癌（2015.V1）