药物代谢酶和药物作用靶点基因检测技术指南(试行)

4. 药物代谢酶和药物作用靶点基因检测分析前质量保证

根据临床检验实验室的条件确定合适的分子诊断项目和恰当的样本处理是确保核酸定性定量检测准确性的关键。标本在检测前必须确保标本的采集、运输和储存符合要求。标本处置不当可能引起核酸降解，导致定量检测结果不准确。

4.1 采样前准备

1）分子诊断项目的申请与完善

药物代谢酶和药物作用靶点基因检测采样前需填写规范的申请单，申请单应包含足够的信息，以识别患者和有资格开具申请单的临床医生。临床医生应根据临床需求合理选择分子诊断项目。个体化用药领域发展迅速，临检实验室应加强与临床医师的沟通，及时指导临床医师选择有价值的诊断项目，帮助医师合理解释检验结果；不断接受正确合理的临床医师的反馈意见，及时了解临床对个体化用药分子检测的需求，优化项目目录。实验室应根据其具体的工作流程，确定质量监测指标，如患者诊断信息完整率、适当临床判断率等，并定期对数据进行回顾性分析，定期对检验申请进行评审。

2）患者的正确识别及知情同意

患者的正确识别是确保获得正确的临床标本的前提。收集标本的容器上应注明患者的信息，通常应包括姓名、送检医院及科室、住院号等。医护人员在采样前需首先核对确定患者的身份，核实能标示患者的信息。

标本收集前应向患者介绍个体化用药基因检测的意义，以得到患者的认同，即知情同意。采样前需告知患者所检测项目的目的、意义、基本过程、项目可能存在的不足如检测结果可能出现与临床用药实际不相符的情况、剩余核酸的去向（包括可能匿名用于科研项目）及保存时间，保护受检者的个人隐私（包括医疗记录和医疗数据）。对实施有创检查的分子诊断项目如穿刺取活检组织，应清楚地告知患者及家属检查可能遇到的风险和紧急情况下的紧急预案。知情同意书是医方履行如实告知义务的证据，也是患者行使选择权的书面依据。

3）送检单的填写与项目的复核

标本采集前需填写送检申请单，提供受检者必需的信息。申请单需填写的信息包括：申请的检测项目、标本编号、受检者姓名、性别、出生日期、民族、采样日期及时间、标本来源（组织类型）、相关临床资料（如身高、体重、疾病诊断、疾病分型分期、合并疾病、用药情况）、采样单位及科室名称、送检医师姓名等信息。临检实验室应有专业人员根据信息采集表对检测项目的合理性进行审核，必要时可与送检医师讨论。

4.2 标本采集

临床分子诊断实验室应对各种个体化用药分子诊断临床标本的采集按检测要求建立SOP。标本采集人员应经过系统的培训。采样前应对标本采集容器进行评价，确保容器本身不会干扰测定过程，并保存评估记录。用于药物代谢酶和药物作用靶点基因检测的标本在采集时间上无特殊要求。静脉血液采集之前应按要求对预采血的部位彻底消毒。肿瘤组织中DNA的分析利用常规诊断所用的标本即可，但用于RNA分析的标本需专门采集，并准备好液氮等速冻所需的材料及设备。标本采集需要在密闭、一次性采样系统中完成，所用的材料如注射器、棉签、拭子等应为一次性使用，以防止污染。无论采集哪种类型的标本，采样时都必须戴手套，以避免标本中病原微生物感染和皮肤脱落细胞对标本的污染。

用于药物代谢酶和药物作用靶点基因检测的标本类型有多种，包括全血标本、组织标本（新鲜组织、冰冻组织、石蜡包埋组织、穿刺标本）、口腔拭子、骨髓、胸腹水等。样本采样原则见《个体化医学检测质量保证指南》。

1）全血和骨髓标本

全血标本采集到含有适当抗凝剂或添加物的采样管中，添加物根据被测量（DNA、细胞内RNA）、检测项目和采样体积而定。因肝素可抑制PCR，全血或骨髓标本一般用EDTA或枸橼酸盐抗凝。采样前需在采样管或注射器上标注标本信息。全血标本采集外周静脉血2~3 mL并置于采血管中，将采血管轻轻颠倒混匀数次以确保充分抗凝，避免溶血。如检测目的是细胞内RNA，建议用含RNA稳定剂的采样管，或采样后尽快将全血或骨髓加入到RNA稳定溶液中。采集干血斑标本时，可向无菌滤纸上滴加约50 L全血，根据需要可连续在数个印圈上滴加标本，于室温自然干燥至少4小时。干血斑标本采集时不要堆叠血斑，不与其他界面接触，待血斑充分干燥后应放入无菌袋中，避免血斑之间的相互污染，同时加入干燥剂和湿度指示卡，密封包装后运送。

2）组织标本

当待检测的组织与血液或口腔脱落细胞基因型不一致时，或当组织是待测核酸必须的来源时（如检测肿瘤组织中mRNA表达、融合基因、基因扩增或缺失、甲基化水平、微卫星不稳定等），需采集组织标本进行检测。可用的组织标本包括新鲜组织、活检组织、石蜡包埋组织和石蜡切片。

a) 新鲜组织和活检组织：采样大小取决于组织类型。一般而言，无论是哪种组织类型，在没有大量脂肪细胞侵润的情况下，10 mg组织标本可提取DNA或RNA 10 g。无菌条件下取米粒大小手术或活检组织（约25 mg）；肿瘤组织要求未坏死肿瘤组织比例>70％。穿刺取实体肿瘤组织时，取得的细胞数与穿刺针的粗细有关，21G细针每次获得100个细胞，19G细针每次获得150个细胞，支气管活检每次获得300个细胞，CT介导的细针穿刺每次可获得500个细胞。通常检测时标本中肿瘤细胞的数量需达到200~400个。在某些情况下，要求同时采集无病变的组织或外周血作为对照（如微卫星不稳定性检测）。组织块取样后的处理与保存见《个体化医学检测质量保证指南》。

b) 石蜡包埋组织：推荐用10％中性缓冲甲醛溶液固定组织标本，避免使用含重金属离子的固定液如Bouin液等。甲醛介导的DNA损伤在固定3小时后明显发生，且时间越长，DNA损伤越严重。因此推荐较小的组织（如活检组织标本）固定6～12小时，较大的组织（如手术切除标本）固定6～48小时。甲醛固定的石蜡包埋组织不适于用作RNA检测，但在没有其他标本可供选择时，可考虑选择没有污染部分提取的RNA用于检测，待测RNA序列的长度最好<130 bp。组织标本切片时应特别注意避免标本间的交叉污染。

c) 组织切片：用于DNA检测时，手术标本需提供10 μm厚的石蜡切片4～8张，面积为成人拇指盖大小；活检穿刺标本提供10 μm厚切片8～10张。所有切片均为白片。肿瘤组织切片应在HE染色后，经病理医师显微镜下观察，以判断是否含有肿瘤细胞及肿瘤细胞的数量是否足够（一般要求>50％）、坏死组织比例<10％，并在对应的白片上画出癌巢，对肿瘤细胞密集区域进行标注。DNA测序法要求肿瘤细胞至少占组织细胞的50％。应采取措施避免核酸交叉污染，制备不同患者病理切片标本时，需更换新刀片。

3）口腔脱落细胞
口腔脱落细胞可同时用于DNA和RNA分析。常用的是口腔拭子，患者清水漱口后，将消毒医用棉签伸进口腔，在口腔内侧脸颊粘膜处左右反复擦拭20次左右，取出棉签，将棉签置于干净滤纸上阴干，每位受检者至少采集棉签3根。棉签立即放入干净封口塑料袋内封闭并放入纸质信封，信封上应做好详细标记。滤纸应经过灭菌处理，以防细菌生长抑制核酸酶的活性。漱口标本也可作为口腔脱落细胞的来源。用于RNA分析的口腔脱落细胞必须保存在RNA稳定剂中。

4.3标本的运输与保存

分子检测人员应熟知标本运送与保存的条件要求。标本一经采集，应尽快送到临检实验室。临检实验室应制定样本运输与保存的SOP。在运送工具的选择、标本的运送和保存环境等方面应严格按规定执行。

运送过程中应防止盛放标本的容器破碎和标本丢失，注意标本的隔离、封装、容器的密闭。标本应标明采集的日期和时间、运送时间、实验室接收时间、实验室接收时标本的温度。运送条件根据标本类型和待测靶核酸的性质而定。DNA分析应在采集后8小时内送达实验室，否则需低温运送。当待测核酸为RNA时，能在10分钟内送达实验室的标本可室温运送；如果运送时间较长，则应将标本置于干冰中，4小时内送达实验室；如果标本中添加了RNA稳定剂，则可室温运送或邮寄。标本的长距离运送应符合生物安全要求。标本运输人员应接受适用于标本类型和远程运输的安全和包装程序的培训。

1）样本运输中需注意的常规事项

a) 放置血液标本的采血管应用石蜡膜或透明胶带封住管盖，以防标本运送过程中采血管管盖脱离；标本运输过程中选用轻质且不易破碎的包装物，并在包装间隙用细碎轻质材料填充。

b) 标本运输和储存过程中要避免将标本暴露于可能导致核酸降解的环境中。

c) 选择可靠的快递公司，样本寄出后应尽快告知检测实验室快递单号及相关信息，以便对样本运输情况进行查询和跟踪。样本要求在尽量短的时间内送达临检实验室。

d) 组织或血液标本的采集过程中可能引起部分基因的表达上调，定量分析基因表达时需考虑到。

2）常见标本运输和保存注意事项

见《个体化医学检测质量保证指南》。

4.4 标本的接收与保存

1）标本的验收、接受与拒收：临床分子诊断实验室应建立严格的标本验收制度和不合格标本拒收制度，并安排专人接收标本。标本验收的内容包括：检查申请单的项目填写是否符合要求、标识是否清楚；申请单有无医师签字；申请单所填项目是否与标本所示一致；申请单姓名、科别、门诊或住院号与标本的标签是否一致；是否签署了知情同意书；核实标本采集及送检之间的时间间隔（要求采样1周以内）；检查标本的量和外观质量，血液标本的外观质量包括采血管是否密闭、有无溶血、管壁有无破损、标本是否有明显的污染迹象（如开盖），样本接收时的大致温度，样本量是否符合要求。手术切除组织标本需做切片和HE染色，由有经验的病理医师评价肿瘤细胞的数量是否满足检测需要。若送检的为DNA样本时，要求体积大于20 μL，OD 260/280为1.6~1.8之间，浓度大于50 ng/μL，琼脂糖电泳后电泳条带大于50 kb。拒收无标签、标签不清晰、采血管破裂、已开盖、运送时间超过1周的样本。拒收标本时应及时与送检单位联系，要求重新采样或重新送样。每个接受的合格标本均应分配一个唯一的标识码。样本签收时实行送样人和收样人双签名制度。标本接收后，如不能立即检测，必须按要求进行适当的保存。

2）样本的登记与录入：样本签收后立即登记样本基本信息，收样日期和时间，并尽快将标本信息录入实验室（或医院）信息系统，后续的操作过程及样本保存均用唯一编号。

3）标本预处理：部分送检标本到达实验室后需进行预处理，如保存于滤纸上的血液标本需采用穿孔机将滤纸上的血斑取下装入离心管中，用溶解液冲洗浸泡滤纸，摇床上室温孵育以除去滤纸上的血红蛋白。为避免交叉污染，一个干血斑取材完毕后，穿孔机需用70％的乙醇彻底清洗，PBS冲洗后，方可用于下一个干血斑的采集。甲醛固定石蜡包埋组织在进行核酸检测前需进行彻底的脱蜡，二甲苯是常用的高效脱蜡有机溶剂。

4）接收后标本的保存见《个体化医学检测质量保证指南》。