二代测序(NGS)技术应用于临床肿瘤精准医学诊断的共识

1. NGS在临床肿瘤诊断中的质量需求:

NGS技术正处于不断的发展和完善过程中,需要对NGS技术现状有正确的认识。但过去十年肿瘤学界的研究和应用显示:在恰当的技术条件下,NGS确实能够高通量地检测分析肿瘤中的驱动基因,给部分患者带来治疗和生存的获益。

在临床实践中各实验室可能有不同的NGS技术平台。无论使用何种平台,各实验室均应该按照本共识中的推荐(声明)开展NGS项目测试,对平台及相关分析工具进行验证后才应用于临床。

针对肿瘤的多基因检测,需要设计特定的NGS测试项目(test)。这些项目的检测结果应能够明确回答临床诊疗所需的基因状态。需要明确指出的是,应该避免分析技术能力尚未得到充分验证的NGS项目在临床应用。

声明1:临床肿瘤诊断应用的NGS项目应符合相应的诊断技术标准。未进行充分验证的NGS技术不应该在临床实践的驱动基因诊断中应用。相关实验室应该明确能够提供的检测项目的内容范围和相关技术参数。

(注:文中的“声明”(statement)是专家组讨论的各个要点,也即专家组形成的共识或推荐)

NGS用于临床肿瘤分子诊断能够带来明确的益处(utility)。NGS技术优势:一次性、特定时间(约10个工作日)产生覆盖基因组特定区域(从数个基因到数百个基因以至外显子组、转录组或全基因组)的通量数据,同步获得多基因、多位点、多种变异形式的分子检测结果。尽管目前NGS的多基因多重分析总成本较高,但相对于传统检测方法而言,单个基因单个位点的检测费用已大大下降。

影响NGS结果的限制性因素包括:平台类别、靶区域富集方法、文库构建及扩增效率、测序数据量、生物信息学分析流程等。在临床应用之前,对于特定突变位点的NGS检测结果在低质量数据条件下应采用其他方法进行结果验证。检测实验室的专家、肿瘤患者的主诊医生与患者应该就开展肿瘤NGS分析的利弊进行充分沟通和知情同意,同时让临床医生了解特定NGS测试项目的医学意义。

声明2:NGS检测项目(Test)的目的和临床益处(utility)应该明确,如果是用于临床靶点抑制剂(靶向药物)的使用决策参考,检测结果应该能够明确一些在临床可采取特定药物靶向治疗的靶点变异信息。NGS测试项目如果是用于分子分型、疗效预测或预后判断则需要在发现集(discovery set)的基础上建立分析模型,再通过技术和验证集(validation set)的验证方可进一步转化应用于临床。

 

2. NGS在临床肿瘤应用的检测内容:

在临床实践中,不同的瘤种既可存在瘤种特异性的驱动基因变异,也可能存在共同的基因变异。一个瘤种存在众多的分子变异亚型,从而提出“同病异治”或“分型而治”的策略;不同瘤种之间由于存在共同的驱动基因分型,则可以采取“异病同治”的策略。由此可见,临床肿瘤的基于基因或基因组学的分子分型将逐步超越传统的病理组织形态学分型,成为临床诊治肿瘤的关键环节。

肿瘤的多基因分型对药物研发策略也产生了重大影响。在药物临床试验设计方面,近年来出现了两种基于分子靶点的试验研究设计类型。一种是“雨伞”设计类型(Umbrella trial design),即针对单个瘤种的基于多个驱动基因分型及其靶向治疗,另一种则是“篮子”设计类型(Basket trial design),是针对多个瘤种的驱动基因的“同型同治”。

无论是临床实践还是临床试验,用于基因分型的NGS检测项目内容需要精细的设计和技术可靠性的验证。NGS项目的检测内容应明确检测哪些基因、相应基因的受检区域、靶点的变异信息等。

声明3:如果NGS用于临床分子诊断,应该明确至少哪些基因需要纳入检测名单(panel list)中。这个必须的“核心基因清单”(core gene list)需要特定肿瘤亚专科相关的临床和实验室多学科专家共同讨论后制定。

“核心基因清单”论证及制定过程中应以“患者的利益”为中心,充分整合临床肿瘤学家对于精准诊治的观点,并充分考虑在我国推广应用的可操作性。以肺癌为例: 目前NCCN及国内肺癌临床指南或卫计委诊疗规范都明确指出EGFR突变、KRAS突变、ALK重排(融合)、ROS1重排(融合)、MET 14号外显子可变剪切变异、MET拷贝数扩增、RET重排(融合)、HER2突变或扩增、BRAF突变等驱动基因变异是临床实践中的重要必须基因。

从CAGC POI项目的恶性肿瘤的整体角度考虑,检测内容(gene panel及其基因组区域)应该既包括各瘤种特异性的panel,也应备有一个大而全的gene panel。因实体瘤和血液肿瘤的变异谱方面的差异较大,因此,在大而全的panel中对实体瘤和血液肿瘤应该分别设计。

“可靶向作用”的原理及定义:驱动基因的定义是参与肿瘤发生发展、转移、耐药等疾病进程中关键步骤的基因。“可靶向作用”基因则是指针对该驱动基因的变异靶点或其上下游关键分子,能够采用靶向药物等手段进行治疗,从而达到抑制肿瘤进展或消退肿瘤的治疗效果。可靶向作用基因也可指该基因的变异可以用来作为明确的分子亚型诊断或预后判断。

声明4:“可靶向作用基因”的变异可能会影响临床决策,医生需要根据基因分型的检测结果来指导临床诊疗方案。“可靶向作用基因”的变异可分为两大类,第一类(Level 1 actionable alterations)包括国际、国内指南(CSCO、ASCO、NCCN、ESMO等)中明确指定的、药物标签中说明的、与FDA/CFDA批准的适应症相关的临床分型基因变异,或是具有明确的分子诊断或预后判断价值的基因变异。第二类(Level 2 actionable alterations)包括正在开展的任何期别(I-III期)临床试验中的药物相关靶点、在已经或即将开展的临床试验中作为入组条件的变异靶点、在国内外指南中其他肿瘤或疾病适应症的药物靶点、用于辅助诊断或预后判断的靶点等。在NGS检测中,对于临床意义非常明确的体细胞突变的少数基因集分析,可以直接检测肿瘤标本而无须设置白细胞等对照样本。但对于需要包含上述第二类可靶向作用基因的更大的基因集分析,尤其是数百基因乃至全外显子组测序等,建议在肿瘤样本进行NGS检测时设置患者自身白细胞样本对照分析。

声明5:随着肿瘤发生发展机制研究的不断深入,新的靶点及药物会得到不断的发现和研发。因此有必要定期或不定期依据重要的临床研究进展对检测内容进行讨论并发布更新。

声明6:检测基因数量越多,诊断信息会越多。但由于肿瘤信号通路的冗余性和复杂性,在基因清单中,除了“核心基因”之外,应该对其他增加的每个基因进行明确定义注释,说明其基因型与潜在可靶向作用位点或通路的关系。在实际的NGS测试项目应用中,检测基因数量的增加不应以核心基因的检测质量受损为代价。

技术参数验证对保证检测结果的准确性很重要。所有NGS计量参数都应该明确说明。在检测中应该记录批次或分析样本特异性的特征。检测实验室应该利用结构化的数据库来保证平台、各分析项目、样本处理等方面的质量分析。在检测分析流程中,每个样本都应该做好唯一性标识。在平台稳定性验证中,应该使得所有仪器和试剂都符合标准要求,提供特定驱动基因的准确性和精确性。
技术验证过程中应该记录在案的相关内容或参数包括以下几方面。1.样本相关的患者信息保护原则、唯一性标识、接收、存储、处理各步骤内容及时间;2. 实验操作过程中DNA/RNA处理每一步骤所用试剂名称、生产厂家、批号,记录每一步操作后的质量指标(如RIN等);3.数据分析及数据库管理相关的软件(包括版本号,分析时所用各项参数)、数据的相关参数(数据量大小,QC等)、数据库的安全性和备份情况等。

声明7: NGS项目的检测流程和生物信息学分析需要针对特定平台和分析项目进行充分优化。流程验证中应提供分析敏感性和特异性的参数。因为分析方法的差异,针对SNV、INDEL、重排(融合)、CNV等不同的变异应该分别测试技术的敏感度和特异度。受样本取材或探针设计等因素影响或限制,NGS在某些变异类型如拷贝数扩增的检测方面有时存在一定的局限性。对于NGS方法准确性可能有影响的情况,应考虑采用可靠的单基因方法对检出变异进行验证。

 

 

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