二代测序(NGS)技术应用于临床肿瘤精准医学诊断的共识

3. NGS应用中的样本处理:

NGS检测需文库构建,该步骤原始材料为DNA或来自RNA的cDNA。适合临床NGS分析的样本类型优先选择新鲜组织标本,也可选用甲醛固定石蜡包埋(formalin-fixed paraffin-embedded,FFPE)样本、肿瘤细胞学标本及血浆(游离DNA/RNA)等。

NGS可用于疾病初诊时的分子靶点分析,也可用于治疗中疾病进展状态的监测及耐药分子机制的诊断。因而在疾病的全程管理中可合理地考虑在诊疗的关键时间节点收集临床标本进行NGS分析。决定是否采用NGS在多个时间节点的检测分析应做好多学科讨论和充分的知情同意。

各类样本采集:(1)对于手术和活检的新鲜组织:理想的保存方法是迅速置于液氮中,可保存于液氮罐或-80℃冰箱,该过程应在手术离体后30分钟内完成,以防止RNA等核酸降解;或采用保存在样本保护剂中,尽早转移到-80℃冰箱保存。可采用冷冻切片染色评估样本中的肿瘤细胞含量。(2)甲醛固定石蜡包埋组织(formalin-fixed paraffin-embedded,FFPE):按病理操作规范进行取材。手术或活检离体的组织应在30分钟内浸入10%中性福尔马林溶液中进行固定,避免使用酸性及含有重金属离子的固定液。大标本应切开后充分固定至6-48小时,不超过72小时。小活检标本可固定6-12小时。开展NGS检测前应进行HE染色评估肿瘤细胞的含量。(3)细胞学样本:胸腹水中的肿瘤细胞用于基因检测时,必须确认是否有肿瘤细胞存在。细胞病理检查之后,符合质量要求的标本可直接抽提核酸,也可以制备成FFPE细胞学蜡块进行后续分析。(4)血浆或血液样本:循环游离/肿瘤DNA(circulating free/tumor DNA,cf/ctDNA)是存在于血浆中的游离DNA,肿瘤来源的DNA占血浆游离DNA的比例在不同肿瘤及病例中相差悬殊。采集外周血提取血浆游离DNA进行检测,取样时应使用一次性的EDTA抗凝真空采血管,采集8~10ml全血,冷藏运输,2小时内分离血浆,提取游离DNA,保存到-80℃冰箱中,并避免反复冻融。如外周血需要长时间运输,建议用商品化的游离DNA样本专用保存管,在常温条件下,cfDNA在全血中可稳定保存3-7天。由于血细胞基因组DNA(gDNA)的潜在大量释放会极大地稀释血浆游离肿瘤DNA的浓度,经肉眼观察确认为溶血的样本不适用于对游离肿瘤DNA的NGS检测。当怀疑血浆游离DNA受到血细胞基因组DNA污染时,可考虑采用核酸片段大小分布分析来判断污染是否存在,而从判断样本是否适用于NGS检测。

采样质量的评价对后续结果的解读有重要意义,临床样本的采样过程、分析前的运输和处理流程以及病理的评估结果等均应做相应的记录。质量评价的内容应包括肿瘤细胞含量比例、肿瘤细胞的数量,是否按照要求进行处理与运输等。评价方法包括肉眼观察、显微镜下观察和血浆样本核酸浓度分析等。对于肿瘤细胞分布集中的区域应进行标注,必要时进行显微切割后再提取核酸。
样本采集和处理中的防污染:样本采集最好采用一次性材料;制备不同患者病理切片样本时,需更换新刀片,并清除操作器皿或切片机上先前样本的残留。

样本运送和保存:实验室应建立详细的样本运送标准操作规程(SOP),对临床医生提供样本采集手册,要求物流人员填写相关运送记录表,确保运送过程中各类样本的安全性和过程的可控性。石蜡材料可常温运输,血浆样本干冰条件下运输,核酸样本需要在4摄氏度或冷冻条件下运输。

声明8:为了提高NGS检测肿瘤驱动基因的准确性,应该提供高质量的临床生物材料样本。不同类型生物材料的收集及处理均应有明确的标准操作流程(SOP)指导。

声明9:样本登记过程中每个标本应该在NGS分析中有唯一性标识。包括来自同一患者的不同组织病灶、不同组织切片、不同核酸样本等均有唯一性的标识。

声明10:样本评估和用量:除了血浆或血液来源的DNA/RNA,凡是涉及形态学的标本,应该在显微镜下评估肿瘤细胞的含量,充分记录各类形态学恶性细胞的含量比例。评估记录还应包括标本收集和处理方法。肿瘤细胞比例低的标本必要时应采用包括显微微切割在内的有效富集肿瘤细胞的方法,提高肿瘤细胞比例。一般情况下,适合于NGS检测的组织标本中肿瘤细胞含量建议应达到20%以上。如果肿瘤细胞占比较低,患者知情后依然愿意进行NGS检测,应该尽量采用显微切割技术富集肿瘤细胞,或增加NGS测序数据量以提高测序覆盖深度(depth),并在报告中提示样本局限性。组织样本抽提获得的DNA量应达50ng以上用于NGS检测。血液样本建议采血至少8ml,分离血浆游离DNA用于NGS检测。

声明11:核酸样本抽提及QC/QA。组织DNA与血浆游离DNA等核酸样本均应进行检测前的质量控制分析,包括核酸的浓度和纯度分析。组织DNA样本应该进行核酸完整性分析,以判断DNA质量。血浆游离DNA样本应该进行片段长度分布分析,以判断是否存在血细胞基因组DNA的污染。在文库构建后应该对核酸样本进行浓度测定与文库片段分布等质量控制。

声明12:为了便于后续采用其他技术方法对检测结果进行验证,在样本留取时,应适当考虑增加生物材料的留取量。在石蜡标本的切片过程中可考虑适当同步预留几张切片用于后续IHC、FISH、PCR测序等方法验证。

 

4. NGS测序技术及流程:

NGS又称大规模平行测序(MPS),是一次性产生大量数字化基因序列的测序技术,是继Sanger测序之后的革命性进步。NGS能够同时对上百万甚至数十亿个DNA分子进行测序,实现了大规模、高通量测序的目标。高通量测序技术不仅可以进行大规模基因组序列的测序,还可用于基因表达分析、非编码小分子RNA的鉴定、DNA甲基化等相关分析。

目前在临床肿瘤实践中,NGS主要应用于驱动基因测序,是肿瘤精准诊疗的重要环节。NGS的优势包括:一次性通量测序、能够分析变异丰度、相对成本低。存在的不足之处包括:满足临床应用的生物信息分析软件尚处于发展之中、基因型的判读依赖于生物信息的准确分析、测序深度在必要时因整体成本高而难以达到等。

就NGS技术本身而言,在临床肿瘤诊断和监测中的应用应充分关注试剂管理、样本的QA/QC、检测环境、人员资质和熟练程度、NGS技术参数标准(包括文库构建、测序流程、质控等)等环节,以标准操作规范加以约束,以保证特定肿瘤NGS测试(test)能够稳定准确地发挥作用。

测序技术的各个环节应该做好实验室规范记录,最好有结构化的数据库进行管理,包括平台环境参数、试剂使用和性能、样本追踪、质控数据等管理。通过日常和定期分析质控保证检测的准确性。
为满足临床需求,实验室需对各个质量控制步骤出现异常、失败的样本规定合理的备选方案。比如采用其他分子诊断平台检测一部分重要位点,或对阳性位点采用其他平台确认性检测,或者重复高通量测序流程等,有条件的检测单位也可以重新选取标本。

声明13:NGS检测需要符合严格的检测环境要求,各类样本的储存、核酸抽提处理及NGS分析应在通过审核验收的临床基因扩增检验实验室完成。

声明14:NGS试剂管理和质控:NGS试剂应该独立存放,防止交叉污染。对于实验室自配试剂或探针及采购试剂,均需做好每批试剂的性能评价,评价合格后才可用于临床样本分析。

声明15:每个特定的NGS测试项目(test)都需要经过严格的技术验证合格后才可以用于临床肿瘤检测。诊断测试项目必须在准确性、分析敏感度、特异度、精确性等方面进行充分评价。如果检测项目中的试剂或步骤有任何主要变更,则质量参数需要重新评价。在针对检测项目更新或升级的重新评价中,应该明确测试所需要的样本类型及例数。强烈建议各实验室参加NGS相关的室间质量评估项目来评测检测能力和质量。

声明16:明确的检测流程包括样本QC/QA、样本预处理、接头连接、预扩增、基因组合(gene panel)靶区的捕获、靶区纯化、扩增文库构建、QC定量后上NGS测序仪检测等步骤。每个步骤的操作和质量控制都应建立SOP进行指导。如果使用扩增子(amplicon)建库的方式,同样需要建立相应的SOP进行质控管理。

声明17:NGS的技术标准应包括上述样本预处理至文库构建、测序、质控的技术标准化,也包括原始数据产生和管理、信息学分析过程的标准化。由此CAGC将在下一阶段可行性验证基础上形成一套NGS技术标准文件(SOP)。

声明18:人员配备和熟练程度应满足实践需求。应配有专门的质控人员。对于参与NGS实验流程操作的技术人员进行充分的培训,达到一定的熟练程度。每个平台应有技术员专职从事实验操作。

声明19:“核心基因清单”与相应的检测标准品将被用于各个实验室间的质控比较。根据检测驱动基因的突变结果描述、目的区域的覆盖度等建立评分体系。这个评分体系将用于对实验室间NGS检测能力的分析与认证。

 

 

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