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临床分子病理实验室二代基因测序检测专家共识
临床分子病理实验室二代基因测序检测专家共识
《临床分子病理实验室二代基因测序检测专家共识》编写组
近年二代基因测序（next-generation sequncing，NGS）技术快速发展，其应用已进展至临床检测，如遗传疾病、实体肿瘤、血液肿瘤、感染性疾病、人类白细胞抗原分析及非侵袭性产前筛查等。 国内外有关学会已出台相关共识与指南以推动其在临床中的应用[1-4]。 中华医学会病理学分会和中国抗癌协会肿瘤病理专业委员会前期组织病理、临床、生物信息等专家进行了充分讨论，拟在NGS的操作流程、数据处理、结果解读等方面作规范和建议，以规范NGS在分子病理领域的应用。
临床分子病理实验室NGS样本可采用甲醛固定石蜡包埋（ formalin-fixed paraffin-embedded，FFPE）组织、新鲜组织、各种体液及其上清液、体液离心细胞蜡块、血浆/血液标本等。 本共识特色是基于病理评估的组织样本（FFPE组织、新鲜组织）而形成的规范。 测序分析范围基于目前临床需求，本共识着重于目标区域测序（panel）分析的实践。 随着技术的更新和应用的成熟，本共识将持续更新以满足临床需求。
一、实验室总体要求
NGS检测实验室的总体设计与要求应参考《分子病理诊断实验室建设指南（试行）》、《医疗机构临床基因扩增检验实验室工作导则》、《个体化医学检测质量保证指南》、《肿瘤个体化治疗检测技术指南》、《个体化医学检测实验室管理办法》、《测序技术的个体化医学检测应用技术指南（试行）》进行[5-7]。
- NGS检测人员的资质要求：NGS检测技术人员应具备临床病理学、分子生物学的相关专业大专以上学历，并经过NGS技术的理论与技能培训合格，同时具有临检中心《临床基因扩增实验室技术人员培训合格证》。 数据分析人员应具有临床医学、分子生物学或遗传学知识背景并经生物信息学培训。 最终报告应由中级或硕士以上具有病理学背景、经培训合格的本单位执业医师或者授权签字人（高级职称或医学博士学位）审核。
- NGS检测实验室的区域设置要求：原则上NGS实验室应当有以下区分：样本前处理区、试剂存储和准备区、样本制备区、文库制备区、杂交捕获区/多重PCR区域（第一扩增区）、文库扩增区（第二扩增区）、文库检测与质控区、测序区、数据存贮区。各工作区空气及人员流向需要严格按照《医疗机构临床基因扩增检验实验室工作导则》配置。分区可根据实际情况合并，但是在前处理和建库时，血液样本与组织样本分开。
- NGS检测试剂及项目要求：试剂和测序平台应选择中国食品药品监督管理总局（CFDA）认可产品。 涉及实验室自配试剂，应该有严格的试剂制备标准操作规程（SOP），需经过临床实验室自建项目（LDT）验证合格才可使用。 每个NGS检测项目在验证时需要根据建库方法、测序平台和分析工具以及不同的突变类型，包括单碱基突变（single nucleotide variant，SNV）、小片段插入或者缺失（Indel）、基因拷贝数变异（copy number variations，CNV）、染色体结构变异（structural variation，SV）以及不同的样本类型（如FFPE组织、新鲜组织、全血、胸水等）对特定panel的准确性、精确性、敏感性、特异性等性能参数进行 LDT验证。 应该有经过标准品测试的在不同的变异频率（mutant allele frequencies，MAF）下，不同测序深度的灵敏度及特异度数据，确定不同样本的可信的测序深度。 经验证后，SOP发生的任何改动，包括试剂、仪器、基因项目等都需要重新做验证。 验证实验结果签名留底备案。
- NGS检测实验室的质量管理要求：NGS检测主要包括实验操作和生物信息学分析两部分。 实验操作部分包括样本准备、文库制备、 编码（barcoding）、目标区域富集、测序等；生物信息学分析部分包括定位（mapping）、比对、变异识别、变异注释、变异解读及报告等。 上述流程均需要建立实验室质量管理体系文件和SOP及机器运行和维护SOP，具有严格的室内质控措施；定期参加室间质评以及有持续的质量保证和改进计划。
二、NGS分析样本、基因panel和转运要求
NGS分析样本类型可采用FFPE组织、新鲜组织、各种体液及其上清液、体液离心细胞蜡块和血浆/血液标本等。
对于肿瘤体细胞变异初次NGS检测应首选经病理评估的组织样本，在此数据基础上的再次检测可选取液体样本动态监测。
NGS检测前需通过病理诊断明确其肿瘤的性质及含量，根据不同肿瘤类型选择合适的基因panel测序[8-11] 。
不同疾病的基因panel列表，必须由临床与检测机构的专家共同决定，在满足临床需求的同时达到最优化的实验设计。
未经病理评估的基因检测结果不可单独用于分子病理临床诊断目的。
样本质量对检测结果和分析至关重要，病理医师需要对可评估的样本进一步明确病理诊断，并评价标本有无出血、坏死和不利于核酸检测的前处理（例如含HCI脱钙液处理），病变细胞（如肿瘤细胞）的总量和比例，避免假阴性。 组织标本中肿瘤细胞含量建议达到20%以上， 低于此标准可富集后检测[12]。
NGS检测实验室应对不同类型的样本有采集及处理SOP指导。 对于不同的样本(FFPE组织、体液、血液等）实验室应有不同的样本运送SOP，物流环节（含冷链运输）应有相关运送记录，确保样本运送安全、无污染、无降解。