药物代谢酶和药物作用靶点基因检测技术指南(试行)

5. 药物代谢酶和药物作用靶点基因检测分析中质量保证

药物代谢酶和药物作用靶点基因检测必须有严格的质量控制措施，涉及基因扩增的检测项目必须在通过技术审核的临床基因扩增检验实验室完成。分析中质量控制的内容包括：实验室设计的要求；检测程序的选择、验证及确认；仪器设备的使用、维护与校准；人员培训；样本的准备（如核酸纯化等）；执行检测；确认检测结果的可靠性。实验室应制定室内质量控制操作程序（SOP）和参加室间质评或实验室间比对。

5.1 实验室设计要求

原则上按照《个体化医学检测质量保证指南》的要求进行。作为药物代谢酶和药物作用靶点基因检测核心技术之一的PCR，要保证结果的可靠性和准确性，首要措施就是防“污染”。检测实验室应按《医疗机构临床基因扩增实验室管理办法》要求进行设置，并按要求严格控制空气流向，避免PCR产物污染。

5.2 检测方法

药物代谢酶和药物作用靶点基因检测过程一般包括核酸提取和靶标检测两阶段。

5.2.1 核酸提取方法

DNA提取用酚-氯仿提取法和盐析法等均可。酚-氯仿法提取可能导致DNA样品中酚或氯仿残留，从而抑制后续的PCR反应。盐析法提取可能存在蛋白质及其他物质的残余，DNA的纯度和得率不高。DNA提取操作要求在生物安全柜内进行。DNA一般溶解在pH为7.2的TE（Tris-EDTA）溶液中，可减少其降解。但如果DNA在提取后几天内用于PCR，也可用双蒸水进行溶解。提取出的DNA要求OD 260/280介于1.6~1.8之间，浓度大于50 ng/μL。

DNA相对稳定，在无DNA酶的情况下，常温下纯化的DNA在TE缓冲液中可放置26周，2~8C冰箱中可放置至少1年。为降低DNA酶的活性和确保DNA的完整性，纯化的DNA标本的长期保存应在0 oC以下的环境中。建议将DNA原液保存于-70oC或以下的环境中。DNA应放置在带盖密封、疏水的塑料管中（带橡胶垫片的塑料管更好，可防蒸发）。聚丙烯容易吸附DNA，尤其是在高离子强度的时候，聚乙烯结合DNA的能力更强。DNA最适于保存在异质同晶聚合物材料的塑料管或经特殊处理的聚丙烯塑料管中。

RNA的提取用异硫氰酸胍结合酚-氯仿提取法，要求提取后的RNA OD 260/280介于1.8~2.1之间，琼脂糖电泳28S:18S≥2。因RNA很容易被降解，纯化好的RNA最好沉淀在无水乙醇中-70 C或更低温度下保存。RNA需储存在灭菌、疏水、并用焦碳酸二乙酯（DEPC）灭活了RNA酶的塑料管中，操作过程需带手套。尽量将RNA溶解于偏碱性（pH 7.1~7.5）溶液中。纯化的RNA在首次冻融后3小时内保持稳定，但反复冻融可导致降解。

5.2.2 药物代谢酶和药物作用靶点基因检测的检测方法

用于靶标检测的方法包括PCR-直接测序法、PCR-焦磷酸测序法、荧光定量PCR法、PCR-基因芯片法、PCR-电泳分析、PCR-高分辨率熔解曲线法、等位基因特异性PCR法、PCR-限制性片段长度多态性方法、原位杂交（ISH）等多种方法，每种方法的原理和优缺点如下：

1）PCR-直接测序法

也称PCR-Sanger测序，该方法基于双脱氧核糖核酸（ddNTP）末端终止法，根据核苷酸在某一固定点开始延伸，随机在某一特定碱基处终止，由于掺入的每个碱基都进行了荧光标记，因此产生了以A、T、C、G结束的四组相差一个碱基的不同长度的系列核酸片段；通过毛细管电泳分离这些片段后读取待测核酸的碱基序列。Sanger法测序是DNA序列分析的经典方法。由于该方法可直接读取DNA的序列，因此被认为是基因分型的金标准。

PCR-Sanger测序法的操作过程主要包括PCR扩增和PCR产物纯化、测序反应、测序和结果分析四个主要步骤。分析时需要设置阴性对照和阳性质控品。该方法属于定性检测，优点是测序长度较长，可发现新的变异位点。主要不足：灵敏度不高，尤其是在进行肿瘤组织体细胞突变检测时，当组织中靶标基因突变比例低于20％时，可能出现假阴性结果；对试剂和仪器有特殊要求，不易普及；操作复杂，成本相对较高，速度慢、通量低。

2）PCR-焦磷酸测序法

本方法是由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应。实验需设计一条生物素标记的测序引物，当引物与单链模板DNA退火后，在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶4种酶的协同作用下，将引物上每一个dNTP的聚合与一次荧光信号的释放偶联起来，通过检测荧光的释放和强度，达到实时测定DNA序列的目的。所需试剂包括样本处理试剂、核酸扩增试剂、单链模板制备试剂、焦磷酸测序试剂和阳性质控品五大类。所需仪器为PCR仪和焦磷酸测序仪。为避免假阳性和假阴性结果，应严格区分阳性质控品和反应试剂的使用，防止因试剂污染致假阳性发生。

该方法的主要优点：检测灵敏度较高，对体细胞突变和甲基化等可实现定量检测；分型准确可靠，通量较高，实验设计灵活，可发现新的突变或遗传变异。主要缺点：对试剂和仪器有特殊要求，不易普及；检测灵敏度有限，对肿瘤组织中的低丰度体细胞突变（<3％）容易出现假阴性；测序长度仅10多个碱基，不能对长片段进行分析。

3）实时荧光PCR法

根据检测原理的不同，实时荧光PCR法可分为探针法和非探针法两种，前者利用与靶序列特异杂交的探针（Taqman和分子信标）来指示扩增产物的增加，后者利用荧光染料或特殊设计的引物来指示扩增产物的增加。Taqman探针法同时综合了5’端核酸酶活性和荧光等技术，其在反应过程使用4条寡核苷酸链，其中两条为等位基因特异性探针，两条为PCR引物。两条探针可分别与突变型和野生型模板互补，其两端分别应用含报告基团和淬灭基团的染料进行标记，两条探针的报告基团荧光染料不一样。在进行SNP检测时，PCR扩增的退火过程导致探针与模板杂交结合，当引物延伸至探针处时，DNA聚合酶的5’端外切酶活性将探针的5’端报告基团从探针上切除，使之与淬灭基团分离，从而释放出相对应的荧光，而没有配对的探针仍然保持完整而不会发荧光。不同的等位基因探针由于标记的荧光染料不同，因此所发荧光信号不同，可通过对荧光信号的检测判断样本的基因型。

实时荧光PCR法灵敏度高，分型准确，操作简便快捷，所用仪器容易普及，易于推广使用。但该方法通量不高，探针成本较高，单个位点的检测成本与样本量有关，样本量越小，成本越高。本方法主要适于对少量位点、大样本进行分型。目前CFDA已批准CYP2C9、VKORC1等多种基因多态性检测的PCR-荧光检测试剂盒。

4）PCR-基因芯片法

该方法以特定的寡核苷酸片段作为探针，将其有规律地排列固定于支持物上，然后将样品DNA通过PCR扩增、荧光标记等程序，按碱基配对原理与芯片杂交，再通过荧光检测系统对芯片上的荧光信号进行检测和分析，从而迅速获得个体的基因型信息。基因芯片分型法的操作过程包括PCR核酸扩增、杂交、芯片扫描和结果分析。该方法用于DNA基因分型时属于定性检测，灵敏度为50 ng/μL。基因芯片法分析时需设置阴性对照和阳性质控品。应用基因芯片检测试剂盒时应确保试剂在开封前按要求保存、各组分液体使用前振荡混匀，杂交和洗片操作务必在避光条件下进行，PCR反应液和定位参照需避光保存，芯片加样时注意使液体铺满整个反应区，但不能溢出、不能出现气泡，以防交叉污染。其主要优点是可同时对多个待测SNP位点进行检测。我国CFDA已批准多种用于药物代谢酶和药物作用靶点基因如ALDH2、CYP2C9、CY2C19、CYP2D6、ADR1、ACE、VKORC1多态性检测的基因芯片试剂盒。

5）PCR-电泳分析

该方法是指对待分析的目的基因片段进行PCR扩增，并通过琼脂糖凝胶电泳或毛细管电泳分析，根据PCR产物的大小对基因多态性位点进行基因分型。该方法属于定性检测，且只能用于对已知的多态性位点进行检测，不能识别未知多态性。琼脂糖电泳法适用于对片段较长的插入缺失多态性进行检测，如ACE插入缺失多态性；毛细管电泳法适于对较短的插入缺失多态性如UGT1A1*28多态性和微卫星不稳定性（MSI）进行检测。PCR过程中需建立阳性质控品和阴性质控品，电泳分析时需同时用分子量标记物进行片段大小的判断。当分子量标记物反应管无条带或出现较弱的条带时，可能的原因包括点样孔漏、荧光染料不够或失效、电泳时间过长或电压过大。该方法的优点是成本低，在普通实验室即可开展；缺点是只适合对DNA插入/缺失多态性或融合基因进行定性测定，不能用于SNP的检测。

6）PCR-高分辨率熔解曲线（HRM）法

该方法通过对PCR反应的熔解曲线分析进行基因分型。PCR扩增的熔解曲线取决于其扩增序列，序列中一个碱基的差异都可导致双链DNA的解链温度发生变化。HRM法应用实时荧光定量PCR仪监测这种细微的温度变化，确定所扩增的目的片段中是否存在突变，从而用于基因分型。HRM分析使用LC Green等饱和荧光染料，该类染料在饱和浓度时对PCR反应无抑制作用，因此可以高浓度使用，从而全部结合DNA双螺旋结构中的小沟。在双链DNA的变性过程不存在荧光分子的重排，其特异度得到大幅提升，因此，熔解曲线细微的变化可以反映扩增片段中碱基的差异。应用本方法进行基因分型属于定性分析。

该方法操作简便、快速、通量大、使用成本低、结果准确，有利于实现闭管操作，在进行甲基化检测时可根据熔解曲线确定甲基化程度的高低。该方法的缺点是：不能排除待测核酸中新出现的遗传变异；由于单个碱基突变导致DNA解链温度的变化非常小，该方法对仪器的灵敏度和分辨率有较高要求。

7）等位基因特异性PCR（Allele-specific PCR，AS-PCR）

又称为扩增阻滞突变系统PCR（Amplification Refractory Mutation System PCR，ARMS-PCR）。该技术的基本原理：由于Taq DNA聚合酶缺乏3’到5’端的外切酶活性，3’端错配的碱基会导致引物延伸速度变慢，当错配达到一定程度时，引物延伸将终止，得不到特异长度的PCR扩增产物，从而提示模板DNA没有与引物3’端配对的碱基，反之则有。因此，AS-PCR反应需要两条等位基因特异的引物和一条共用的反向引物，两条非特异性引物在3’端与模板错配，但其他部分碱基序列完全一样。只有引物的3’端与模板完全配对时，PCR扩增才可以进行。PCR产物可通过凝胶电泳进行分析和基因型的判断。该方法也可与实时荧光定量PCR结合起来进行基因分型。该方法可以用于检测各种类型的SNP，其优势是灵敏度高，特别适合于对肿瘤组织中的体细胞突变进行检测；缺点是假阳性率较高。

8）PCR-限制性片段长度多态性方法

限制性片段长度多态性方法（RFLP）是一种基于酶切原理的方法，是最早用于基因分型的经典方法之一，现在仍被广泛采用。该方法主要基于某些限制性内切酶可以特异性识别某一特定序列和结构DNA，并对其进行剪切的原理。限制性内切酶通常识别双链DNA的某一特定序列，并在特定位置或者附近将双链DNA切断，从而产生较短的DNA片段。由于限制性内切酶识别序列的严格性，一个碱基的变化都可以导致酶切活性的消失。利用这一特性，若待分型的SNP位点在某一限制性内切酶的识别位点上，将会导致该酶只对其中的一种等位基因具有酶切活性。因此，对位于限制性酶切识别位点的SNP进行分型时，可以使用包含该位点的PCR产物与相应的限制性内切酶进行温育。酶切以后的产物进行电泳，并根据酶切产物片段的大小来进行基因分型。该方法不需要任何探针，也不需要特别的仪器设备，成本较低，实验过程简单，可操作性强。但缺点也很明显，主要是通量太低，大量分型时工作量大，并且只适用于部分SNP分型。

9）原位杂交（ISH）法

ISH法以各种人体标本，包括相应实验方法制备的细胞学和组织学标本（福尔马林固定石蜡包埋）作为靶标，采用目的DNA探针与该靶标进行分子杂交，从而检测相关的靶基因异常。ISH技术按照探针标记物的类型，可分为亮视野原位杂交和荧光原位杂交（FISH）。ISH法检测的靶标具有完整的细胞核，无需进行核酸的提取。其具体的方法学原理见《原位杂交（ISH）指南》。在药物代谢酶和靶点基因检测中，ISH法主要用于测定基因扩增和基因缺失异常。

表1. 各种药物代谢酶和药物作用靶点基因检测技术优缺点及适用性比较

5.2.3 药物代谢酶和药物作用靶点基因检测项目及类型

遗传药理学知识库（PharmGKB）根据项目成熟程度将个体化用药基因检测项目分为4级，并认为其中1级项目（包括1A级和1B级）满足临床应用的最高标准，而4级项目适于临床应用的证据最少[1]。1A级项目为同时获临床遗传药理学实施联盟（Clinical Pharmacogenetics Implementation consortium，CPIC）、认可CPIC药物基因组学指南的医学会、以及美国国家卫生研究院药物基因组学研究网络（Pharmagenomics Research Network，PGRN）认同的项目，这类项目通常经大规模随机对照临床试验（RCT）对项目的意义进行了论证；1B级项目有确切的临床证据提示相关性，且这种相关性被具有一定样本规模的研究所证实，但还需进一步的临床证据。根据检测项目所涉及的基因在影响药物反应中的作用机制和被测靶分子（DNA或RNA）的不同，个体化用药分子检测项目包括药物代谢酶与转运体基因遗传多态性检测、药物作用靶点基因遗传变异检测、其他基因变异检测和药物作用靶点基因mRNA表达检测四种类型（附录C）。

5.3仪器设备的使用、维护与保养

原则上按照《个体化医学检测质量保证指南》的要求进行。药物代谢酶和药物作用靶点基因检测涉及的仪器设备众多，实验室可参考生产商提供的操作说明书编写书面的、有案可查的预防性维护及校准计划，确定仪器设备的维护周期，建立仪器设备日常维护的SOP。对于某些计量分析仪器，应依照我国计量法规定，由计量检定机构定期进行校验，并保存好校验证书。加热系统及冰箱等设备的维护包括对温度进行监测。仪器维护过程中要注意清洁剂的使用，尤其是仪器的光路系统。每台仪器应该配备专用的清洁工具。在例行仪器的维护和保养后，应填写仪器维护保养记录表。如维护中发现问题，应及时汇报并将出现的问题详细记录，最后由维护操作人员签名。

5.4人员培训

原则上按照《个体化医学检测质量保证指南》的要求进行。药物代谢酶和药物作用靶点基因检测通常要涉及试剂配制、核酸提取、仪器编程、结果分析和报告等步骤。操作人员需要有一定的专业技术知识和经验才能获得稳定可靠的检测结果。加强人员培训是确保检测质量的关键。人员培训分为入职培训、内部培训和外部培训。通过培训，让操作人员掌握和建立安全操作的概念、“防污染”的概念、具备独立进行质控活动和仪器维护的能力，可对试剂和质控品的出入库及使用情况、设备保养等情况进行准确记录，进行数据分析。实验室工作人员在培训后书面确认其已接受适当的培训，阅读并理解了相关SOP。实验室应对实验室工作人员进行处事能力考核和周期性能力再考核，定期开展内部培训。外部培训包括国家卫生计生委临床检验中心和国家卫生计生委个体化医学检测培训基地等机构组织开展的各种技术培训。

5.5检测体系的性能验证

原则上按照《个体化医学检测质量保证指南》的要求进行。临床检验实验室应用的体外诊断试剂包括国家药品食品监督管理总局（CFDA）批准的试剂盒和国家卫生计生委个体化医学检测试点单位通过性能评定、具有严格标准操作规程（SOP）的自配试剂（LDT）。所有试剂都需进行性能评价。实验室所购买的商业化的仪器应根据说明书进行验证。在报告结果之前实验室应该证明其性能能够满足厂家规定的准确度、精密度、线性与可报告范围和参考区间。实验室还应该为每个检测系统建立性能规范，包括适用性、准确度、精密度和分析特异性（包括干扰物质）、可报告范围和其他重要特性，并根据性能规范确定系统的校准和质控程序，保持性能特征建立、校准和质控程序相关活动的记录。同时也需对检验中的耗材进行质检。

个体化医学分子检测包括定性检测和定量检测。定性检测的性能验证指标主要包括重复性/精密度、准确度（突变型的检测能力）、分析特异性、检出限等，可参考美国临床实验室标准化协会（CLSI）的EPl2一A2文件进行。定量检测监测体系性能验证的指标主要包括准确度、精密度、线性、可报告范围、检出限、参考区间、灵敏度、特异性等。

准确度的评价有两种方法，一种方法是与标准物质进行比较，使用待评估的项目对已知标准的标准物质（如定性检测中用到的阳性参照品）进行分析，将检测结果与已知标准值进行比较；第二种方法是同时用待评估项目与标准方法（或参考方法）对同一批次样品进行分析，然后将不同方法得到的结果进行对比分析。精密度是指重复检测条件下，获得的独立测量结果间的一致程度，是对检测体系随机误差的一种度量，常用标准差表示，标准差越小精密度越好。定性检测的精密度还包括一份阳性或阴性样本在多次检测中，是否能得到可重复的阳性或阴性结果。药物代谢酶和药物作用靶点基因变异检测体系进行准确度、精密度等性能验证时所使用的参考物质为各种突变型和野生型质粒或突变细胞株。

线性分析可直接分析已知浓度的样品，也可将一定浓度的样品进行系列稀释后，根据稀释因子来研究检测值与逐步下降的预期估计浓度之间是否存在线性。可报告范围是能够报告的可靠的最低和最高检测结果，实验室可通过“多点法”进行简单验证，推荐应用5个不同浓度水平的样品进行验证。

LoD是指可被检测体系检出的最低检测浓度，又称最小检测浓度或检测底限。建立和验证LoD时，需同时建立、验证空白检测限。检出限一般由厂家、方法建立者完成，实验室LDT试剂应确立方法的LoD。

临界值是鉴别样品、作为判断特定疾病、状态或被测量物存在与否的界限的量值。测量结果高于临界值判断为阳性，低于临界值判断为阴性，接近临界值判断为非确定性。临界值的选择决定检验的诊断特异性和诊断灵敏度。目前已有部分临床治疗指南将药物靶点基因的mRNA表达水平高低（如ERCC1和RRM1）作为指导用药的依据，然而目前对待测靶mRNA表达水平临界值的确定尚未明确。分子诊断实验室可通过绘制受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic，ROC）确定诊断阈值，得到合适的敏感度和特异度。ROC曲线趋左上角靠近，曲线下面积就越大，其临床检验的准确性就越好。临检过程中应按照试剂盒生产商的说明或定义定期对临界值进行评审。

LDT试剂的性能评估包括样品的类型与数量、所选择的参比方法、评价指标、准确度、重复性与精密度、线性范围、检测范围、分析的灵敏度与特异性、参考区间或cut-off值及临床性能评估结果。具体可参考国家卫计委《个体化医学检测LDT研制技术规范》。