药物代谢酶和药物作用靶点基因检测技术指南(试行)

7.药物代谢酶和药物作用靶点基因检测的质量保证

药物代谢酶和药物作用靶点基因检测的质量控制与保证是个体化医学检测质量保证的核心内容，是个体化用药基因诊断规范化和标准化的首要前提。因此临床检验项目的计划和准备，试验性能确认/验证以及检验全过程都需要建立有效的质量控制体系。

7.1 检测确认和特征描述

在将检测用于临床工作之前应该对方法进行分析确认和临床确认。实验室应确定待检测的靶核酸、确定要使用的试验方法和建立试验性能确认/验证的计划和程序。确认/验明程序应该包括：检验目的；靶基因，基因序列和突变；预期患者人群；被比较的试验方法，或要使用的方法；使用的样本类型；要确定的分析性能特征；参考材料的来源；如何分析性能规范，如何规定试验的局限性；出现问题时的纠正措施。

7.2可操作性的SOP编写

有可操作性的标准操作规程（SOP）是个体化医学检测实验室质量管理的灵魂。SOP源于仪器和试剂说明书、一些标准文件和实验室实验工作经验的积累，应包括试剂准备、标本采集、标本接收与预处理、核酸提取、测定方法、结果分析和报告、仪器操作、实验室安全措施等临床检验的各个环节。SOP的编写应注意通俗易懂、注重细节、清晰明了、图文并茂。实验室工作人员应严格遵循SOP中的步骤要求进行操作，当发现SOP有“故障”时，经过技术研发小组的工作人员讨论、实验验证后及时修改。

7.3质控品与室内质控

7.3.1质控品

所有药物代谢酶和药物作用靶点基因检测都需要选择一定的质控样本进行质控分析。质控样本的选择视检测项目而定，如药物代谢酶的SNP检测的阴性质控样本可以是无相关突变的同类样本和不含任何核酸的水样本，阳性质控样本可以为以前检测过的特定基因突变已知的样本或体外构建的已含特定突变质粒的细胞株。常用的做法为：在每次检测时同时设立试剂对照、阴性质控、阳性质控、弱阳性质控，且这些质控样本与待检样本同时进行检测，每隔一定数量的临床标本插入一份质控样本。当同时检测多个变异位点时，可根据实验室的条件设立针对2～3个位点的阴性或阳性对照，但不同批次间要注意更换阴性和阳性对照样品。

质控样本的质量与实验结果的可信度密切相关。理想的室内质控样本应该具有以下特点：基质一致，即与待测样本具有相同的基质；稳定性好，在适当的储存条件下能保持较好的稳定性；检测结果应该是确定的，且越接近试验的决定性水平越好；具有安全性，不得有生物传染危险性；单批可大量获得，以便于长期连续监测。

7.3.2室内质量控制的方法

应用统计学原理或非统计学方法判断测定批次的结果是失控还是在控，是室内质控的核心。室内质量控制的方法包括统计学质量控制和非统计学质量控制两大类。一般而言，定性检测（如基因分型）采用非统计学质量控制，而定量检测如基因表达水平检测、基因甲基化水平测定、以及实验室“污染”所致的假阳性定量检测一般采用统计学质控。统计学质控主要从不精密度和偏离度两个方面确定检测程序或分析方法稳定性的性能特点，其具体做法是在常规检测临床标本时，除阴性质控外，还要对连续的一个浓度梯度的阳性质控样本进行检测，分析判断质控样本的测定结果是否偏出所用方法的测定范围，进而决定常规临床测定标本结果的有效性。统计学质量控制的前提是制定在最佳条件和常规条件下实验室变异的基线。在进行不精密度测定时，一般至少对20个不同的样本连续检测不少于20天，每天2次。偏离度的测定可采用基准线法、与参考物质的检测结果比较、与其他平行单位的检测结果比较、与其他检测方法的检测结果比较等多种方法。部分定性检测方法因可计算出样本中突变等位基因的比例，也可应用统计学质控方法进行质控分析。

统计学质量控制方法主要包括两大类：阳性样本测定重复性统计质控方法和假阳性的统计质控方法。阳性质控品测定重复性统计能较准确的反映实验室仪器、试剂、实验员操作的稳定性，也是实验室实时监控检测结果是否可信的重要手段，其主要统计控制方法包括基线测定、Levey-Jennings质控图方法、Westgard多规则质控方法、累积和（CUSUM）质控方法及“即刻法”质控方法。假阳性的统计质控方法包括根据日常患者结果阳性率的Levey-Jennings质控图和直接概率计算法两种，其中Levey-Jennings质控图法是目前临床检验中应用较为广泛的一种方法，适合于质控样本多次重复、检测结果可用数值表示且呈正态分布的情况。

Levey-Jennings质控图法的具体做法是：样本处理（核酸提取）时加入流程阴参，所有步骤与待测样本一致；加模板时，各检测位点均应设置阴性对照（即以流程阴参为模板，用于检测是否发生“污染”）与一定比例的突变型/野生型阳性标准品[23]。PCR扩增时注意前后批次阴参和阳参的孔槽摆放位置的随机性。所有阴参、阳参的检测结果应符合预期值，记录各个阳性质控品PCR扩增产物检测结果。用Levey-Jennings质控图进行统计分析，根据质控规则判断检测结果是否在控。质控规则如下：

12S：1个质控测定值超出X±2S控制线，预警。

13S：1个质控测定值超出X±3S控制线，失控。

22S：同一批次2个连续的质控测定值或不同批次的2个质控测定值同时超出X+2S或X-2S控制线，失控。

R4S：同一批测定中，2个不同浓度质控物的测定值之间的差值超出4S控制线，失控。

41S:4个连续的质控测定值同时超出X+1S或X-1S控制线，失控。

7T：7个连续的质控测定值呈现出向上或向下的趋势，失控。

10X：10个连续的质控测定值同时处于均值（X）的同一侧，失控。

只有当使用所有质控规则判断确定测定值在控时的检测结果方为可信结果，而只要上述质控规则之一判断测定值失控即认为该测定值失控。阴参检测结果为阳性，也判定为失控。一旦失控出现，当日所有检测结果无效，必须暂停实验并及时查明原因，采取改进措施，直至测定结果在控后方可重新开始临床检测。每次出现失控情况需填写失控记录，详细记录失控原因、采取措施及其效果，失控报告应及时通报公布，以免反复出现同一原因导致的失控。

7.4室内质量控制的评价

实验室应有专人对实验过程各个阶段及实验数据进行质检。在日常临床诊断服务过程中，如果发现阳性质控标本结果偏高、偏低或阴性，或阴性质控品检测为阳性，则应立刻查找失控原因，并采取预防措施。

阳性质控品失控常见的原因包括模板问题、引物或探针问题、仪器问题或试剂问题。应对策略包括：纯化核酸、高浓度小量分装、避免核酸反复冻融；换用新的检测试剂；标本重复双份测定；对可能含PCR扩增抑制物的标本进行稀释等。

阴性质控品呈阳性提示核酸“污染”，污染来源可能是扩增产物和（或）核酸提取过程中的交叉污染。如果临检标本全都阳性，提示扩增产物或试剂污染，应更换试剂或进行实验室清洁、通风；如果临检标本部分阳性、部分阴性，考虑为扩增产物轻度污染或标本间交叉污染，可通过对5～8份水样品进行检测，查明污染来源，阳性提示实验室污染，则应进行实验室清洁、通风，阴性要提醒临检人员注意操作过程。

7.5室间质量评价

临床检测实验室应参加室间质量评价（EQA），对待EQA样本不能特殊化，详细、如实地记录参与EQA的全过程，根据反馈结果了解本实验室的能力、自查存在的问题，及时寻求改进方法，解决问题，完善实验室质量控制体系，以促进实验室更好的发展。EQA评分包括绝对评分和相对评分。绝对评分就是看实验室对该次所有质评样本检测结果与预期结果相符的标本总数占该次全部样本的百分比，大部分项目大于80%即可视为检测结果满意或合格。药物代谢酶和药物作用靶点基因检测的EQA还需对检测报告的填写规范程度、文字错误、报告清晰度、结果报告揭示的充分性等进行评价。

为保证室间质评的质量，需要注意以下几点：

1）参加质评实验室报告结果要清楚、简洁；

2）参加质评实验室使用与常规样本完全相同的方法来测定室间质控样本；

3）室间质评报告要迅速及时；

4）室间质评样本的来源和浓度与临床患者标本要尽量一致；

5）室间质评样本必须在发放条件下稳定；

6）不存在不可避免的传染危险。

8.制度

临床检验过程中需遵守国家对医疗机构和临床检验实验室的其他相关规定。

1) 医疗机构及临床实验室相关管理条例：《医疗机构管理条例》、《医疗机构临床实验室管理办法》、《医疗机构临床基因扩增管理办法》、《医疗机构临床检验项目目录》、《医疗质量控制中心管理办法（试行）》、《实验室质量手册》、《医学检验所基本标准（试行）》。

2) 标本处理的相关条例：《血站质量管理规范》、《血站实验室质量管理规范》、《血液标本留取程序》、《血液检验样本目测检查标准》、《血液的贮存发放与运输管理程序》和《血液样本接收处理标准操作规程》。

3) 医疗废物处理的相关条例：《医疗废物管理制度》。